cDNA的质量能通过电泳或者OD值来判断吗？

一段有趣的对话，趣味的同时让人学到知识。问：判断反转录出来的cDNA 质量的好坏通过OD值是否准确？

小荷:

师兄，问你下，判断反转录出来的cDNA 质量的好坏通过OD值或者电泳是否准确？

小瑞：

这种问题，反复都说过很多遍了，我得总结一下，省得一次次说

小瑞：

1. cDNA去跑电泳检测的或者测所谓cDNA浓度的，深深的暴露了自己基础知识的缺乏。需要去学习核酸生化这门课程，至少要知道RNA的组成。我这辈子以前没有，现在没有，将来也不会去跑一次cDNA电泳，或者测一次cDNA浓度来判断cDNA好坏！

小瑞：

2. 判断cDNA好坏，或者反转录是否成功的唯一有效方法就是最后的PCR结果，普通PCR结果，看谁扩增的亮；荧光定量PCR结果，看谁起来的CT值早；如果还有其它的方法，欢迎来让我开开眼界。

小智：

筛库的时候还是需要对cDNA进行电泳的

小瑞：

筛库是什么东西，我不了解，但是cDNA跑电泳你怎么判断好坏的？我想开开眼界

小智：

做三代测序，进行大小筛选，或建酵母文库都需要进行cDNA电泳

小瑞：

大小筛选和cDNA好坏不是两码事么？你要筛选大小，通过电泳进行分离，这个当然好理解，不跑胶，没法分开。我的意思是你如何通过跑cDNA电泳，来判断cDNA的好坏。

小瑞：

我是反对，通过跑电泳来判断反转录是否成功或者好坏。

小瑞：

通过跑电泳，来判断cDNA质量和好坏，就很搞笑了，或者我想知道怎么样的电泳图，是代表是好的，怎么样的电泳图，代表反转录不好？

小瑞：

我们看看RNA的组成，就很清楚为啥反转录效果没法通过跑电泳和测OD比值来知道。

小瑞：

首先广义的总RNA，包括4种RNA：

1. 核蛋白体RNA（简称rRNA）这个就是我们常说的28S， 18S，5S，这个占了总量的85%
2. 转运RNA：tRNA
3. 信使RNA：（mRNA）
4. microRNA：miRNA

小瑞：

从总量看，总量的85%是核蛋白体RNA，而且大小就3种，所以能看见3条带，而mRNA， 只占RNA总量的1%-5%，而且还是几百种表达基因的总和。每一种基因，可能连0.01%都看不见，所以没法看见条带，只能表现为28s和18s之间和上下的拖尾、涂抹带和背景荧光而已。

小瑞：

那么我测量了总RNA去做反转录， 真正能做反转录的mRNA只有1-5%， 85%是没用的28s，18s，5s。就算1:1所有的mRNA都转录成cDNA， 你看不见mRNA， 难道翻倍就能看见cDNA么？它最多是和mRNA一样，表现为背景荧光，这个背景荧光和mRNA本身的背景荧光是不是一样的？更要命的是，85%的核蛋白体RNA，在转录过程中一般都会降解，降解后它会不会形成更多的涂抹带，背景荧光， 你怎么分得清楚背景荧光是来源于mRNA还是cDNA、还是降解的核蛋白体RNA?

小瑞：

况且大家知道核酸的增色效应，降解的RNA，85%的RNA， 降解的RNA， 会完全覆盖掉cDNA的存在，它造成的吸光值的增色效应，会远远大于来源于cDNA的吸光值

小瑞：

打个比方，一个人考10分，一个人考15分， 两个人还可以比较一下，谁好一点， 来一个95分的，10分和15分的立刻成为学渣，而且是没有区别的学渣。就好像王思聪说的，交朋友，我不在乎钱，和他相比，所有的人都是穷人

小瑞：

就是这个道理，1%的cDNA在85%的降解的核蛋白体RNA的完全掩盖下，你怎么能通过跑电泳，或者OD比值来发现它的好坏？

小瑞：

所以大家可以百度一下，通过跑电泳，判断cDNA好坏的标准，你百度得出来么？RNA电泳的好坏有明确标准，28s：18s比值，你看看cDNA好坏的标准，网上能查出来么？

小瑞：

反转录时间不同，降解的程度不同，cDNA真电泳了，那电泳图肯定是千奇百怪的，实际你看到的不是cDNA电泳图，你看到的是降解的核蛋白体RNA的电泳图。随着降解程度不同，表现不同而已。

小瑞：

不管对错， 起码说明很多人赞同无法电泳检测cDNA吧？如果一个东西是明确的1+1=2一样的正确，就不会有这么多争议了

小瑞：

小瑞：

小瑞：

有人跑的cDNA电泳图， 大家看看是不是和我说的一样？与其说这是一个cDNA电泳图， 不如说是我刚才说的不同降解程度的核蛋白体电泳图

小瑞：

这样的所谓cDNA，你去测OD，你觉得测出来的是cDNA么？还是那没有降解完全依旧可见的85%的核蛋白体RNA?

小瑞：

小瑞：

小瑞：

基础知识缺乏的人还挺多的， 弥散就说明反转录成功了，降解的RNA，可不是弥散嘛？ 你就是不加反转录酶，去42度孵育1个小时，看看RNA会不会弥散（降解），按照这些网友的说法，弥散了，反转录就成功了。然后你惊喜的发现不加反转录酶的也弥散了，恭喜你， 不用反转录，你就得到了cDNA。

大家努力学习吧！

相关产品推荐