• 说明书丨HRF0462-HRbio™ Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(with gDNA Removal)逆转录试剂盒（包含基因组DNA清除剂）.pdf

产品信息 

产品描述

      本产品是一种高效、稳定、快速并可以去除基因组 DNA 污染的反转录系统。试剂盒采用新一代反转录酶，大大提高了稳定性和反转录效率。本试剂盒为一管式反转录预混液，5×RT Master Mix 中含有反转录第一链合所需的所有试剂（RTase、RNase Inhibitor、Random primers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、Buffer）。通常Real Time RT-PCR等实验需要先用 DNase I 消化去除RNA中残留的基因组DNA(gDNA) ，但是传统DNase I处理复杂并容易造成RNA的降解和损失。本试剂盒中使用了具有DNA分解活性的4×gDNA Removal 可2分钟消除gDNA残留，不需要DNase消化和后续繁琐步骤。

适用范围

第一链cDNA合成。可用于高拷贝、低拷贝基因的检测。

产品组成

*5×RT Control Mix 和5×RT Master Mix 成分完全一致，只是不含RTase 反
转录酶，可以用于反转录的阴性对照。

运输和保存方法

－20℃ 保存，有效期 12 个月。

产品特点

1、新一代反转录酶大幅度提高了稳定性和反转录效率。

2、采用gDNA Removal仅需2分钟清除DNA残留，不需要DNase 消化和后续繁琐步骤。

3、全预混的反转录Mix，只需加入RNA和水，15分钟简单快速完成反转录。

4、同时2种Mix在-20℃不易冻结，减少了化冻和混匀时间，使用更简单。

5、本产品针对qPCR进行特别优化oligo dT和N6随机引物配比，使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始并具有相同的反转录效率，最大程度保证了qPCR结果的真实性和可重复性。

操作步骤

(以20 μl反应体系为例，也可以采用10μl反应体系)

1、将模板RNA和5×RT Master Mix在冰上解冻；4×gDNA Removal 和RNase free H₂O 在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液轻弹或者轻微涡旋振荡混匀，可简短离心以收集残留在管壁的液体到管底。

2、在RNAse free管里面加入以下成分：(建议使用PCR管冰上配制)

*Total RNA 建议不超过 2 μg，mRNA 不超过 200 ng (20μl 体系)

3、移液器轻轻吹打混匀，42℃孵育2分钟（或者37℃孵育5分钟）。控温步骤均建议PCR仪器上进行。

4、继续直接在同一管加入如下成份：

5、移液器轻轻吹打混匀（总体积20 μl）

如使用mRNA模板是来源于真核细胞（如人、小鼠的组织细胞）含有Poly(A)尾结构，42℃孵育15-20min。

如使用mRNA模板是来源于原核细胞（细菌）或者病毒等不含Poly(A)尾结构，25℃孵育10 min，42℃孵育15-20min。

注意：如果模板具有复杂二级结构或高GC区域，可尝试将反应温度提高至50℃，有助于提高产量。

6、85℃加热 5 sec 失活RTase和gDNA Removal。

7、得到的cDNA产物可立即用于qPCR反应，或在-20℃保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-70℃保存。cDNA应避免反复冻融。

RT-qPCR

      取适量反转录cDNA产物（一般不超过qPCR反应体积的1/10）作为qPCR模板，按照厂家荧光定量PCR试剂说明书进行下一步荧光定量PCR。 如果表达基因含量丰富，可以根据实际适当稀释cDNA模板使用。

注意事项:

1、避免RNase污染。

2、为保证反转录成功建议使用高质量的RNA样品。

3、4×gDNA Removal 、5×RT Master Mix 非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用前请点甩离心后使用，并且避免吸头外壁沾附损失。4×gDNA Removal和5×RT Master Mix内包含的酶均为过量，即使每次按照3.6 μl-3.8 μl使用，也不影响使用效果。 

4、可以不经过基因组去除步骤，直接用5 ×RT Master Mix 进行反转录，这样所得到的结果会与使用RT Master Mix相当。