• 说明书丨HRN0162-SerumPlasma microRNA Kit 血清血浆microRNA提取试剂盒.pdf

产品信息

产品描述

      目前对RNA干扰和调节性小RNA的研究，需要一种能有效提取15-30核苷酸左右大小RNA（包括siRNA和miRNA）的试剂盒。但是传统的RNA提取方法如硅胶膜不能有效吸附回收，酚/胍抽提和异丙醇或者乙醇沉淀并不能有效沉淀回收微小分子RNA，对于血清血浆样本更是由于其自身特点更难提取。本试剂盒采用独特的裂解液迅速直接裂解血清血浆RNA酶，强烈有机抽提去除蛋白和DNA，RNA包括微小分子RNA在高浓度乙醇下吸附于离心柱内特殊硅基质膜， 再通过一系列特殊漂洗液快速的漂洗－离心的步骤，漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质进一步去除， 最后低盐的洗脱液将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

产品特点

1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

2.也不需要异丙醇或者乙醇沉淀等容易丧失微小分子RNA的步骤。

3.特殊的裂解液配方，可以处理更多的血清/血浆样品。

4.多次柱漂洗确保高纯度，可用于RNAi，RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

适用范围

适用于从动物及人体血浆和血清中纯化包括miRNA的无细胞总RNA

产品组分

运输和保存方法

1）本试剂盒在室温储存6个月不影响使用效果。

2）所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。

3）不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。

4）Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用就可以。

5）避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

注意事项

1.第一次使用前请先在Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入。

2.除说明外，所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13，000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

3.需要自备乙醇，氯仿。

4.Lysis buffer 和Wash Solution 1含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

5.预防RNase 污染，应注意以下几方面：

1)经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。

2)使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。

3)RNA 在裂解液中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。

4)配制溶液应使用无RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%( v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）

6.RNA 纯度及浓度检测：

通常情况下通过测量OD260值可以知道RNA产量，测量OD260/OD280 比值可以是衡量蛋白质污染程度的指标之一，但是由于血清/血浆的RNA含量特别低，已经低于分光光度计测量的下限，无法测量准确，因此一般无法通过测量OD值或者比值的方法来判断纯度或者浓度，只能通过下游做荧光定量RT-PCR来判断产量。同时无细胞的血清/血浆中的RNA主要是小于100 nt的小RNA，因此传统的电泳检测RNA完整性并不适用于血清/血浆RNA

7.本产品仅作科研用途！

使用方法（提取包含microRNA的总RNA）

提示：

→第一次使用前请先在Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇！

1.每250μl样品(血清，血浆)加入750μl Lysis buffer，涡旋振荡或者用加样枪吹打液体样品几次混匀帮助裂解

   对于含有高污染物样品如高蛋白高血脂样品，可以适当减少处理量，不足的体积，可以用去RNase-free H₂O补足。Lysis buffer和液体样品的终体积比总是3：1。例如200μl样品+50μl RNase-free H₂O+750μl Lysis buffer。

2.将样品剧烈震荡混匀，在15 -30°C条件下孵育5分钟。

3.每750μl Lysis buffer加200μl 氯仿，剧烈振荡15秒并室温下放置2分钟。

4.于4℃12,000rpm 离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加Lysis buffer体积的70%。

5.小心取上清（精确计算体积）转入到新的离心管，加入1.5倍体积的无水乙醇（必须是室温的），涡旋混匀。此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心，立刻接下步。

6.将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm离心30-60秒，弃掉废液。

7.加700μl Wash Solution 1（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液

8.加入500μl Wash Solution 2/3（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl Wash Solution 2/3，重复一遍。

9.将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10.取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-40μl RNase free water（事先在 100℃水浴中预热效果更好）， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。
洗脱液加回到吸附柱重复洗脱一遍可以提高产量和浓度(如果需要RNA浓度高)。如果需要提高浓度，洗脱体积最小可以低至15μl，但是使用小体积洗脱会降低一些产量。