• Minute™ 植物高尔基体富集试剂盒 PG-049_CN.pdf

产品信息

产品描述

      植物高尔基体在细胞生理结构和蛋白转运中起着重要的作用。然而高尔基体蛋白质组学的研究因高尔基体富集和纯化方法有限而受阻。传统分离高尔基体采用密度离心法，这既繁琐又费时，通常还需要大量的起始原料。众所周知，植物的高尔基体堆不稳定，如果使用一般的匀浆方法，则可能会导致高尔基堆完整性下降，这意味着无法使用电子显微镜的形态学手段来评估高尔基体。本试剂盒克服了传统方法缺点，通过使用基于离心管柱的匀浆方法，通过差速离心和选择性沉淀来富集高尔基体。该方案简单明了，只需要毫克量的起始原料，高尔基体组分就可以获得显著富集（2-3倍）。

应用

      试剂盒用于快速从植物组织中富集天然高尔基体，可应用于 SDS-PAGE，immunoblottings，ELISA，IP，膜蛋白质结构分析，2-D，酶活性测定及其他应用。

使用说明

1. 将 200-250mg 新鲜植物叶片或幼苗加到离心管柱中，将叶片折叠卷起塞入到离心管柱中。加入 100ul 缓冲液 A，用 200ul 吸头按压叶片 100-200 次以压缩叶片体积（此步大概需要 2-3min）。

2. 用试剂盒中提供的研磨棒用力向下扭转按压研磨 200 次（大约 2-3min）。（注意：研磨棒可重复使用，用70%酒精擦拭或用蒸馏水冲洗干净，用纸巾擦干。）

3. 再加 400ul 缓冲液 A 到离心柱中，用 200ul 吸头将样品搅拌混匀。盖上盖子，5000Xg 离心 10min。离心后，将 500ul 上清转移至一新的 1.5ml 离心管中。

4. 加 50ul 缓冲液 B 到离心管中，涡旋震荡混匀，冰上孵育 30-40min。

5. 孵育完成后，11000Xg，离心 10min，离心后将上清完全弃除。小心加入 1ml 预冷的双蒸水，不要打散沉淀，迅速去除所有液体，这样可以去除附着于管壁的 rubisco。

6. 加 150-200ul 缓冲液 C，用移液器上下吹打 30-40 次将沉淀重悬。在冰上孵育 15min，每 5min 涡旋振荡一次。孵育完成后，5000Xg，离心 5min 去除聚集颗粒（通常是一些浅绿色的沉淀）。

7. 将上清转移到一个新的离心管中，加入上清液 1/10 体积的缓冲液 D (例如上清液有 200ul，加入 20ul 缓冲液 D)。这个混合液就是富集的高尔基体组分。可以直接用 BCA 法测定蛋白浓度。通常蛋白得率在 40-60ug每个样品。

8. 如果不立刻进行下游实验，可以将产物保存在-80 度。验证高尔基体的富集情况，需使用高尔基体专用标志物抗体进行 WB 检测，同时使用组织总蛋白做对照，验证时，确保总蛋白和高尔基体蛋白等质量上样。分离得到的高尔基体组分，与合适的上样缓冲液混合处理后，可直接用于 SDS-PAGE 和 WB 检测。用于其他应用推荐使用下方列表中溶解液，例如做 IP，Co-IP 实验建议在高尔基体溶液中按 1:1 加入 WA-010后进行下游实验。

储存条件

4℃下储存。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）本产品仅作科研用途！