• 说明书丨HRF0195-HRbio™ Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TwoStep gDNA Removal)二步法基因组DNA去除逆转录试剂盒.pdf

产品信息

产品描述

      本制品以RNA为模板，采用预混合技术，用5×HRbio™ III RT Reaction Mix（已经预混合了HRbio™ III Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor、Random primers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、Buffer）高效合成第一链cDNA，操作简单。

      本制品采用分子进化技术，高达60°C的全新高温反转录酶，可以通读GC含量丰富，二级结构复杂的RNA模板，极大提高反转录效率和长度。 可用于更长的cDNA合成以及高比例的全长cDNA文库的构建等。本试剂盒中使用了具有DNA分解活性的特殊gDNA Remover，只需一步操作，即可同时完成基因组清除与逆转录反应，极大简化了操作步骤，避免了复杂加样过程造成的样品污染与RNA降解的风险。

产品用途

第一链cDNA合成。可用于高拷贝、低拷贝基因的克隆和检测，尤其适合GC含量高，复杂模板的高温反转录。

产品特点

1.新一代高温反转录酶极大提高了包括复杂RNA模板的反转录效率和长度。合成cDNA长度高达15 kb以上。

2.全预混的反转录Mix，只需加入RNA、引物和水，简单快速完成反转录。

3.gDNA Remover仅需2分钟清除DNA残留，不需要DNase 消化和后续繁琐步骤。

4.预混合Mix在-20°C不冻结，减少了化冻和混匀时间，使用更简单。

5.本产品针对qPCR进行特别优化oligo dT和N6随机引物配比，使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始并具有相同的反转录效率，最大程度保证了qPCR结果的真实性和可重复性。

产品组分

*5×HRbio™ III RT Reaction Control Mix不含反转录酶，其他组分与5×HRbio™ III RT Reaction Mix完全一致。

运输和保存方法

干冰运输。-20℃保存，避免反复冻融，有效期1年。

注意事项

1）避免RNase污染。

2）为保证反转录成功建议使用高质量的RNA样品。

3）可选步骤（一般不需要）：如果RNA模板GC含量丰富或者有复杂二级结构、或者扩增cDNA长度超过3kb，可以先只加RNA模板、引物和和RNase free H2O混匀，65°C变性5分钟，冰上冷却，短暂离心后加入其它成分继续下面的反转录步骤。

4）5×HRbio™ III RT Reaction Mix和gDNA Remover含甘油很粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用前请点甩离心后使用，并且避免吸头外壁沾附损失。5×HRbio™ III RT Reaction Mix内包含的酶均为过量，即使每次按照3.6 μl-3.8 μl使用，gDNA Remover按照0.8 μl-0.9 μl也不影响使用效果。

使用方法

第一链cDNA合成(以20 μl反应体系为例)

1.将模板RNA和5×HRbio™ III RT Reaction Mix 在冰上解冻；4 × gDNA Eraser Mix和RNase free H₂O在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液轻弹或者轻微涡旋振荡混匀，可简短离心以收集残留在管壁的液体到管底。

2.在无酶的PCR管中加入以下成分（建议冰上配制）

*Total RNA建议不超过2 μg，mRNA不超过200 ng (20μl体系)

3.移液器轻轻吹打混匀，42℃孵育2分钟（或者37℃孵育5分钟）。控温步骤均建议PCR仪器上进行

4.继续在同一管中加入如下组份：

5.移液器轻轻吹打混匀（总体积20 μl），孵育
如使用mRNA模板是来源于真核细胞（如人、小鼠的组织细胞）含有Poly(A)尾结构，42℃孵育15-20min。
如使用mRNA模板是来源于原核细胞（细菌）或者病毒等不含Poly(A)尾结构，25℃孵育10 min，42℃孵育15-20min。
注意：如果模板具有复杂二级结构或高GC区域，可尝试将反应温度提高至50℃，有助于提高产量。

6.85℃加热 5 min 失活反转录酶和gDNA Remover

7.得到的cDNA产物可立即用于qPCR反应，或在-20℃保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-70℃保存。cDNA应避免反复冻融。

RT-PCR

取适量反转录cDNA产物（一般不超过qPCR反应体积的1/10）作为qPCR模板，按照荧光定量PCR试剂说明书进行下一步荧光定量PCR。 如果表达基因含量丰富，可以根据实际适当稀释cDNA模板使用。

注意事项：

1.避免RNase污染。

2.为保证反转录成功建议使用高质量的RNA样品。

3.5×HRbio™ III RT Reaction Mix和gDNA Remover含甘油很粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用前请点甩离心后使用，并且避免吸头外壁沾附损失。5×HRbio™ III RT Reaction Mix内包含的酶均为过量，即使每次按照3.6 μl-3.8 μl使用，gDNA Remover按照0.8 μl-0.9 μl也不影响使用效果。

4.本产品仅作科研用途！