谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,GDH)试剂盒

谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,GDH)试剂盒

价格:580

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产品信息

 

产品名称

测定方法

产品编号

规格

谷氨酸脱氢酶(GDH)试剂盒

分光光度法

HRK0621

50管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

 

测定意义

                 

GDH(EC 1.4.1.2)广泛分布于植物中,和谷氨酸合成酶(GOGAT)共同参与谷氨酸的合成,在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作用。

 

测定原理

 

GDH催化NH4+、α-酮戊二酸和NADH,生成谷氨酸和NAD+,引起340nm吸光度下降。通过测定340nm吸光度的下降速率,计算GDH活性。

 

需自备的仪器和用品

 

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

 

试剂组成和配制

 

提取液:液体60mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体60mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×2瓶,4℃保存;

 

粗酶液提取

 

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

血清(浆)样品:直接检测。

 

测定步骤

 

分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

样本测定

(1)在试剂二中加入25mL试剂一充分溶解混匀,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min;现配现用(配好后12h内用完)

(2)取0.05mL样本和0.95mL工作液于1mL比色皿中,混匀,加工作液的同时开始计时,在340 nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和5分20秒时的吸光度A2,计算ΔA=A1-A2。

 

GDH活性计算

 

1、血清(浆)中GDH活力的计算:

单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=643×ΔA

2、组织、细菌或细胞中GDH活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=643×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T=1.286×ΔA

V反总:反应体系总体积,1×10-3 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.05 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

注意事项

本产品仅作科研用途!

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