价格:581
货号His-tag Protein Purification Kit (His标签蛋白纯化试剂盒)
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产品详情
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产品信息
产品名称 |
产品编号 |
规格 |
价格(元) |
His-tag Protein Purification Kit (His标签蛋白纯化试剂盒) | HRD0155 | 5mL | 581 |
HRD0156 | 25mL | 1800.00 | |
HRD0157 | 100mL | 4800.00 |
产品描述
本试剂盒包含了Ni-NTA填料、亲和纯化柱和his蛋白纯化所需要的全部试剂(包括细菌裂解液、蛋白酶抑制剂、结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液等组分),本产品中的Ni-NTA树脂以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质,通过偶联NTA为配体,在螯合镍离子后,形成的稳定八面体结构复合物。本产品具有较高蛋白载量和高度稳定性,是His标签蛋白纯化中极佳的选择。
产品组分
组分 |
货号/规格 | ||
HRD0155(5mL) | HRD0156(25mL) | HRD0157(100mL) | |
Ni-NTA Resin | 5mL | 25mL | 100mL |
细菌蛋白提取试剂 | |||
Protease Inhibitor Cocktail | |||
层析空柱(12mL) | |||
1M 咪唑 | |||
1M NaH2PO4 |
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3M NaCl |
实验步骤
一、纯化流程
1 缓冲液的准备
缓冲液使用原理:低咪唑上样,高咪唑洗脱,或者高pH上样,低pH洗脱。Buffer 在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤除菌。
2 样品准备
2.1 细菌表达的蛋白(本说明以细菌表达的蛋白纯化为例)
1)挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中,根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
2)表达结束后,将培养液转至离心瓶,7000 rpm,离心15 min,收集菌体,然后加入1/10体积的裂解液(Lysis buffer)和PMSF(PMSF在破碎前加入,其终浓度为1 mM),同时也可加入其他蛋白酶抑制剂,但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
3)之后加入溶菌酶,使其工作浓度为1 mg/mL。
注:如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE,可以不加入溶菌酶。
4)将菌体沉淀悬浮起来(如果菌液浓度高,可考虑加入10 µg/mL RNase A和5 µg/mL DNase I),混匀,置于冰上超声破碎细胞,至菌液基本保持澄清。
5)收集上述澄清蛋白液至离心管中,10000 rpm,4℃离心20-30 min。取上清,置于冰上备用或-20℃保存。
2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白
将细胞培养液转移至离心瓶,5000 rpm离心10 min,收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等,即可直接上柱纯化;如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质,则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
注:对于大量体积的上清,需加入硫酸铵进行沉淀浓缩,之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。
2.3 包涵体蛋白纯化(以细菌为例)
1)将培养液转移至离心瓶,7000 rpm,离心15 min,收集菌体去上清。
2)按照菌体:裂解液=1:10(w/v)的比例将菌体充分悬浮,混匀,冰浴超声破碎。
3)将破碎液转移至离心管,10000 rpm,4℃离心20-30 min,去上清。可重复步骤2)和3)一次。
4)按照菌体:裂解液(含8M尿素)=1:10(w/v)的比例将包涵体充分悬浮。
5)变性条件下纯化His标签蛋白纯化。
3 装柱
1)用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头,确保柱底筛板上无气泡,关闭柱底出口,并在柱底部留出1-2 cm的去离子水。
2)将树脂悬浮,小心地将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。
3)如果使用储液器,应立即在层析柱和储液器中加满水,将进样分配器放置于浆液表面,连接至泵上,避免在分配器或进样管中产生气泡。
4)打开层析柱底部出口,开启泵,使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱,然后缓慢增加至最终流速,这样可避免液压对所形成柱床的冲击,也可以避免柱床形成的不均匀。如达不到推荐的压力或流速,可以用所用泵的最大流速,这样也可以达到一个较好的装填效果。当柱床高度稳定后,在最后的装柱流速下至少再上3倍柱体积的去离子水。标上柱床高度。注:在随后的色谱程序中,不要超过最大装柱流速的75%。
5)关闭泵,关闭层析柱出口。
6)如使用储液器,去除储液器,将分配器置于层析柱中。
7)将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器,锁紧分配器接头。
8)将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中,开始平衡。如需要可重新调整分配器。
4 样品纯化
装柱后,可用各种常规的中压色谱系统,以AKTA使用为例进行说明:
1)将泵管道注满去离子水。去掉产品上塞,连接至色谱系统中,打开下出口,将纯化柱连接到色谱系统中,注意旋紧。
2)3-5倍柱体积去离子水冲洗纯化柱。
3)至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。1ml规格预装柱推荐流速为1 mL/min,5 mL预装柱推荐流速为5 mL/min。
4)利用泵或注射器上样,收集流出液,以便SDS-PAGE检测蛋白结合情况。
注:若样品粘度增加,即使上样体积很少也会导致层析柱很大反压;上样量不要超过柱子的结合能力;大量样品体积也可能造成很大的反压,使得进样器更难使用。
5)Wash Buffer 平衡柱子,直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10-15个柱体积)。
注:在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。
6)Elution Buffer一步法或梯度法进行洗脱。一步法洗脱中一般5倍柱体积洗脱液即可。梯度洗脱可以用一个小的梯度,例如20倍柱体积或更多来分离不同结合强度的蛋白质。
7)建议用更高浓度咪唑(如500 mM)彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。随后依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂,最后将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中,置于4℃保存。
5 SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等)利用SDS-PAGE进行检测,判定其纯化效果。
二、在位清洗
当填料使用过程中发现反压过高(>0.5 Mpa)或者填料上面出现明显的污染时,需对其进行在位清洗(Cleaning-in-Place,CIP)。在位清洗时,先把Ni2+脱掉,清洗结束后,将填料保存在20%乙醇中,后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物,如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。
1 去除强疏水结合的蛋白,脂蛋白和脂类
使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积,接触时间为15-20 min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1 M醋酸溶液,接触时间为1-2 h。去污剂处理后,需用70%的乙醇清洗5倍柱体积,彻底去除去污剂。最后利用去离子水清洗10倍柱体积。
2 去除离子作用结合的蛋白
使用1.5 M NaCl 溶液接触10-15 min,之后用去离子水清洗10倍柱体积。
三、填料再生
当填料使用过程中发现反压过高(>0.5 Mpa),填料上面出现明显的污染,或填料载量明显变低时,需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理,即填料再生。按照下面操作流程进行:
1)使用5倍柱体积去离子水清洗填料;
2)使用5倍柱体积100mM EDTA(pH 8.0)剥落镍离子;
3)使用10倍柱体积去离子水清洗填料;
4)使用0.5M NaOH清洗5倍柱体积,停留10-15min;
5)使用10倍柱体积去离子水清洗填料;
6)使用3-5倍柱体积100mM NiSO4再生挂镍;
7)去离子水清洗10倍柱体积。
填料再生后,可立即使用,也可保存在20%乙醇中,置于4℃备用。
注意事项
1)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
2)本产品仅作科研用途!
运输与保存方式
冰袋运输。4℃保存。有效期2年。