• 说明书丨HRD0155-His-tag Protein Purification Kit (His标签蛋白纯化试剂盒).pdf

产品信息

产品描述

      本试剂盒包含了Ni-NTA填料、亲和纯化柱和his蛋白纯化所需要的全部试剂（包括细菌裂解液、蛋白酶抑制剂、结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液等组分），本产品中的Ni-NTA树脂以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质，通过偶联NTA为配体，在螯合镍离子后，形成的稳定八面体结构复合物。本产品具有较高蛋白载量和高度稳定性，是His标签蛋白纯化中极佳的选择。

      本产品载量：≥40mg标签蛋白/mL 填料

产品组分

注意事项

1、在纯化之前采用电泳检测蛋白的可溶性，本试剂盒只适合于可溶性蛋白的纯化。

2、缓冲液中不建议使用 β-巯基乙醇、DTT和EDTA。

3、纯化过程中不要将凝胶脱水变干。

4、为提高纯化效率，首先确定Binding Buffer和Elution Buffer中咪唑的最佳使用浓度。必要时可以使用线性或梯度浓度的咪唑浓度，Binding Buffer的范围为0-10 mM，洗脱缓冲液的范围为10-500 mM来进行。并通过SDS-PAGE或Western Blotting来检测目的蛋白的纯度。

5、请使用高纯度的试剂配制缓冲液，并通过0.22 µm或者0.45 µm过滤器过滤。为避免柱子被堵塞，建议将裂解液进行离心，或者使用0.22 µm或者0.45 µm过滤器过滤。

6、柱再生时，保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。

实验步骤

一、纯化流程

1 缓冲液的准备

缓冲液使用原理：

可溶性蛋白纯化缓冲液配方。

配制100mL Binding buffer为例：加入2mL的1M Tris-HCl（pH7.9）、加入1mL的1M 咪唑、加入16.67mL的3M NaCl，用去离子水定容到100mL；

配制100mL Binding buffer为例：加入2mL的1M Tris-HCl（pH7.9）、加入50mL的1M 咪唑、加入16.67mL的3M NaCl，用去离子水定容到100mL；

2 层析柱组装

2.1将Ni-NTA填料（5mL）混匀后加入层析柱，室温静置10分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。

注： 1）填料的上层是乙醇保护层，将填料和乙醇一起混匀，以每ml填料纯化40mg 左右His标签蛋白计算，取适量的填料与乙醇的混合液加入层析柱。
      2）如果乙醇不流出，可以给柱子一个外力，例如用大拇指对柱口轻轻按压一下，迫使乙醇流出。
      3）本实验都是通过重力作用使溶液流出。

2.2 向装填好的柱中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用10倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子，平衡结束后即可上样。

注： 柱体积指的是填料的体积。

3 蛋白的纯化

1、收集菌体后，每100 mg菌体（湿重）加入1-5 ml细菌裂解液（每1 ml 细菌抽提试剂中已加入10 μl 蛋白酶抑制剂混合物），超声裂解菌体。

注意：1） 当提取物粘度高或提取蛋白为包涵体时，建议加入DNase I和Lysozyme。每1 ml 细菌抽提试剂中加入1 μl DNase I（1,000 U/ml），2 μl Lysozyme（50 mg/ml），DNase I和Lysozyme需单独购买
         2）超声过程中保持菌液处于冰浴中，超声条件依赖于所使用的超声仪功率，探头种类，容器的大小形状，需实验中自己摸索，应避免连续超声导致的大量产热，可分成短时间，多次超声，通过一定的
间隔时间避免溶液过热。最终菌液变清即可

2、10000 rpm,4℃离心3分钟，收集上清中的可溶性蛋白。

3、用Binding Buffer将菌体裂解液等倍稀释后负载上柱，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液。

注意：1）本试剂盒中附带有一块筛板，使用时先将筛板加至填料的上层，该筛板可用于杂质较多的蛋白的过滤，防止过多的杂蛋白堵塞柱子的作用。再将处理好的样品负载上柱，但是筛板放入柱子后就不易取出。
        2）通过控制加入的菌体裂解液的速度来控制流速。

4、使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白。

5、使用适量Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。

注意：洗脱峰可以分管收集，每1 ml收集1管，并采用蛋白监测仪监测，收集洗脱峰。

6、洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），封柱后2-8℃保存。

注意：如果是分段梯度洗脱，最大洗脱缓冲液中咪唑浓度未达到500 mM时，则使用浓度为500 mM的咪唑进行洗脱10倍柱体积后，再进行第6步的操作。

4 SDS-PAGE检测

将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

二、填料再生

当填料使用多次后，结合效率会有所下降（表现为流速变慢或填料失去蓝绿色），可以用以下方法再生，提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。按照下面操作流程进行：

1）使用2倍柱体积的6 M盐酸胍冲洗后，使用3倍柱体积的去离子水冲洗；

2）使用1倍柱体积的2% SDS冲洗；

3）依次使用1倍柱体积的25%、50%、75%和5倍柱体积的100%乙醇冲洗，再依次使用1倍柱体积的75%、50%和25%的乙醇冲洗；

4）使用1倍柱体积的去离子水冲洗；

5）使用5倍柱体积含50 mM EDTA缓冲液（PH8.0）冲洗；

6）使用3倍柱体积去离子水，3倍柱体积20%乙醇冲洗；

7）去离子水清洗10倍柱体积；

8）使用5个柱体积的50 mM NiSO₄（硫酸镍）过柱；

9）使用3个柱体积的Binding Buffer平衡。

填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃备用。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）本产品仅作科研用途！

运输与保存方式

冰袋运输。4℃保存。有效期2年。