• HRK2317-尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶试剂盒.pdf

产品信息

正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

UDPG焦磷酸化酶是生物体糖原合成过程中的关键酶。在葡萄糖合成糖原前催化葡萄糖活化，将1-磷酸葡萄糖与UTP分子合成为UDP-葡萄糖（UDPG）。

测定原理

UGP可逆催化反应生成1磷酸葡萄糖，在磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下将NADP转化为NADPH，340nm的吸光值增加速率反映了UGP活性。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计、1 mL石英比色皿。

试剂组成和配制   

提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加5mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂三：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加5 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂四：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加5 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂五：液体5mL×1瓶，4℃保存。

酶液提取

1.组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置冰上待测。

2.细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置冰上待测。

3.液体：直接检测。

测定操作

1.分光光度计预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2.取1mL石英比色皿，依次加入500μL试剂一，100μL试剂二，100μL试剂三，100μL试剂四，100μL试剂五，100μL粗酶液，充分混匀，记录340nm处30s的吸光值A1和330s的吸光值A2，△A=A2-A1

计算公式

（1）按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADP定义为一个酶活力单位。

UGP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1 nmol的NADP定义为一个酶活力单位。

UGP（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=321.54×ΔA÷W

（3）按照细胞数量计算

酶活单位定义：每10⁴个细胞每分钟消耗1 nmol的NADP定义为一个酶活力单位。

UGP（nmol/min /10⁴ cell）= [ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.643×ΔA

（4）按照液体体积计算

酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗1 nmol的NADP定义为一个酶活力单位。

UGP（nmol/min/mL）＝[ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹]÷V样÷T=321.54×ΔA

V反总：反应体系总体积，1×10^-3 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g ；500：细胞或细菌总数，500万。

注意事项

本产品仅作科研用途！