果糖-6-磷酸激酶(6-phosphofructokinase,PFK)试剂盒

 果糖-6-磷酸激酶(6-phosphofructokinase,PFK)试剂盒

价格:680

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产品信息

 

产品名称

测定方法

产品编号

规格

果糖-6-磷酸激酶(PFK)试剂盒

分光光度法

HRK1115

50管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

 

测定意义

 

PFK(EC 2.7.1.11)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖-1,6二磷酸和ADP,是糖酵解过程的关键调节酶之一。

 

测定原理

 

PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映PFK活性。

 

需自备的仪器和用品

 

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

 

试剂的组成和配制

 

提取液:60mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体40mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存,临用前加入2.8mL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20度保存,禁止反复冻融;

试剂三:粉剂×1支,4℃保存,临用前加入260μL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20度保存,禁止反复冻融;

试剂四:液体16μL×1支,4℃保存,临用前加入260μL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20度保存,禁止反复冻融;

 

样本的前处理

 

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为1000~5000:1的比例(建议2000万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

3、血清(浆)样品:直接检测。

 

测定步骤和加样表

 

1、分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、工作液(可测25个样)的配制:取19mL试剂一和1.26mL试剂二充分混匀;用不完的试剂分装后-20度保存,禁止反复冻融;

3、将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟。

4、加样表:

试剂名称(μL)

测定管

工作液

800

样本

30

试剂三

5

试剂四

5

将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中,立即混匀,加试剂四的同时开始计时,记录在340 nm波长下20秒时的初始吸光度A1和10分20秒时的吸光度A2,计算ΔA=A1-A2。

注意:不同匀浆组织中PFK活力不一样,做正式试验之前请做1-2只预试,若ΔA>0.5,则说明活力太高,必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算公式中乘以相应稀释倍数),或缩短反应时间至2min或5min,使ΔA<0.5,以提高检测灵敏度。

 

PFK活力单位的计算

 

1、血清(浆)PFK活力的计算:

单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=450×ΔA

2、组织、细菌或细胞中PFK活力计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=450×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=450×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(2000×V样÷V样总)÷T=0.225×ΔA

V反总:反应体系总体积,8.4×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.03 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;2000:细菌或细胞总数,2000万。

注意事项

本产品仅作科研用途!

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