肉桂酸-4-羟化酶( Cinnamic acid-4-hydroxylase,C4H)试剂盒

肉桂酸-4-羟化酶( Cinnamic acid-4-hydroxylase,C4H)试剂盒

价格:850

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产品信息

 

产品名称

测定方法

产品编号

规格

肉桂酸-4-羟化酶(C4H)试剂盒

分光光度法

HRK2842

50管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

 

测定意义

 

C4H又称反式肉桂酸-4-单氧化酶,多存在于高等植物、酵母、菌类中,该酶催化肉桂酸羟化作用产生4-香豆酸盐,是苯丙烷途径中继L-苯丙氨酸解氨酶之后的第二个关键酶。

 

测定原理

 

C4H催化肉桂酸和NADP生成4-香豆酸盐和NADPH,在340nm下测定NADPH生成速率,即可反映C4H活性。

 

需自备的仪器和用品

 

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

 

试剂的组成和配制

 

提取液:100mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体60 mL×1瓶, 4℃保存;

试剂二:粉剂×2瓶,-20℃保存;

 

粗酶液提取

 

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

 

测定步骤

 

1.分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2.样本测定

(1)取试剂二一瓶,加入25mL试剂一充分溶解混匀,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min;现配现用(配好后24h内用完)

(2)在1mL石英比色皿中加入50μL样本和950μL试剂二,混匀,立即记录340nm处初始吸光值A1和 5min后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。

 

C4H活性计算

 

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

C4H(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

C4H(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=643×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

C4H(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=1.286×ΔA

V反总:反应体系总体积,1×10-3 L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.05 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

注意事项

本产品仅作科研用途!

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