价格:210
货号Ca++ Mg++- ATP酶活性测定试剂盒
产品详情
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产品信息
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产品名称 |
测定方法 |
产品编号 |
规格 |
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Ca++ Mg++- ATP酶活性测定 |
分光光度法 |
HRK0918 |
50管/24样 |
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
Ca++ Mg++-ATP酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化ATP水解生成ADP和无机磷。
测定原理
根据Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP生成ADP及无机磷，通过测定无机磷的量来确定ATP酶活性高低。
需自备的仪器及用品
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
提取液： 液体50mL ×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体 5ml×1 瓶，4℃保存。
试剂四：粉剂×3 支，-20℃保存。用时每支加1mL蒸馏水，现用现配；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂五：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。
试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存。用时加入3mL蒸馏水， 4℃保存。
试剂七：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水，溶解后4℃保存一周。
试剂八：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水，溶解后4℃保存一周。
试剂九：液体25mL×1 瓶，室温保存。
试剂十：10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。
0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂十 20倍稀释，即取 0.1mL试剂十加1.9mL蒸馏水充分混匀。
定磷剂的配制：按H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
样品酶液的制备
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
操作步骤
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。
2、酶促反应（在EP管中加入下列试剂）
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对照管 |
测定管 |
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试剂一（μL） |
130 |
90 |
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试剂二（μL） |
40 |
40 |
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试剂三（μL） |
40 |
40 |
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试剂四（μL） |
40 |
40 |
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试剂五（μL） |
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40 |
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样本 （μL） |
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200 |
混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）准确水浴10min
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试剂六（μL） |
50 |
50 |
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样本 （μL） |
200 |
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混匀，8000g，25℃离心10min，取上清液
3定磷（1.5mLEP管中依次加入下列试剂）
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空白管 |
标准管 |
对照管 |
测定管 |
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0.5μmol/ml标准磷应用液（μL） |
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100 |
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上清液（μL） |
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100 |
100 |
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蒸馏水（μL） |
100 |
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定磷试剂（μL） |
1000 |
1000 |
1000 |
1000 |
混匀，室温放置30 min，在 660nm处比色。
注意事项：
1、由于每一个样都必须做对照，本试剂盒50管只能测 24份Ca++ Mg++-ATP酶。
2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。避免磷污染是检测成败的关键。
3、空白管和标准管只要做一管。
计算
1、血清（浆）Ca++ Mg++- ATPase活力的计算:
定义：规定每小时每毫升血清（浆）中Ca++ Mg++- ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力（μmol /h/ mL）=[ C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷V样÷T=7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）
2、组织、细菌或细胞中Ca++ Mg++- ATPase活力的计算：
（1）按蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白中Ca++ Mg++- ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h/mg)=[C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷（V样×Cpr）÷T =7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
定义：每小时每克组织中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h/g)= [C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(W× V样÷V样总)÷T=7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
定义：规定每小时每1万个细菌或细胞中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h /104)= [C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(500×V样÷V样总)÷T=0.015×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）
C标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V总：酶促反应总体积，0.5mL；V样：加入样本体积，0.2mL ；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1/6小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500万。
注意事项
本产品仅作科研用途！