• 说明书丨HRF0701-HRbio™ Ⅲ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit miRNA逆转录试剂盒(加尾法）.pdf

产品信息

产品描述

      本产品miRNA第一链合成试剂盒采用Poly(A)加尾法原理，首先在miRNA 3’末端加Poly(A)尾，再使用 Anchored oligo(dT)-universal tag 通用逆转录引物进行逆转录反应，在逆转录酶的作用下生成 miRNA 对应的第一链cDNA。本产品使用特殊优化预混合 miRNA RT Enzyme Mix 将 Poly(A)加尾和逆转录合并为一步完成，大大简化了操作步骤并提高 Poly(A)加尾和逆转录效率， 本产品可从20pg-2μg 的 Total RNA 中有效制备 miRNA 对应的第一链cDNA。

产品用途

用于miRNA对应cDNA第一链的合成。本产品可从20pg-2μg 的 Total RNA 中有效制备 miRNA的cDNA。

本产品需与HRbio™ miRNA qPCR Kit miRNA荧光定量PCR试剂盒配套使用。

产品组分

运输和保存方法

干冰运输。-20℃保存，避免反复冻融，有效期1年。

使用方法

miRNA 3’末端进行Poly (A)加尾和逆转录反应（第一链合成）

1.解冻2×miRNA RT Reaction Mix并混匀，miRT Enzyme Mix放于冰中备用，加入以下试剂至总体积20μl(注意：最后加入miRNA RT Enzyme Mix)

2.移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在42°C反应60 min。

3.85°C加热5秒钟失活miRNA RT Enzyme Mix。

4.合成的cDNA反应液可放置于-20°C保存；也可以直接进行下游PCR或者荧光定量PCR检测。

注意事项

1）miRNA RT Enzyme Mix比较粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用前请点甩离心，并且避免吸头外壁沾附损失。Enzyme Mix内酶都是过量的，即使每次按照 1.8μl使用，也不影响使用效果。

2）在反应中使用的total RNA 必须包含有小分子RNA(miRNA)。此过程也可以使用富集的miRNA， 单纯miRNA无法直接用分光光度计定量，建议直接加入2μl ~5μl。可根据目的miRNA丰度决定加入量，但是对于低丰度miRNA 样品而言(如血清血浆提取物)，可直接加入最大体积8 μl。

3）按照上述操作步骤得到的cDNA模板用于下游PCR或者荧光定量PCR检测时，可以根据实际情况选择使用量，对于特殊的检测体系中，高含量的cDNA 模板易导致非特异性扩增，可根据所检测miRNA 的丰度适当的稀释cDNA（5-10倍或者100倍）后使用。如果发现有非特异扩增条带，或者溶解曲线显示有非特异扩增，往往提示cDNA模板过量， 可以尝试将上述cDNA模板稀释几十到几百倍甚至上千倍再使用。

4）本产品仅作科研用途！