• 说明书丨HRN0331- 植物microRNA快速提取试剂盒.pdf

产品信息

产品描述

      独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，植物RNA助提剂PLANTaid帮助结合多糖多酚并通过离心去除，然后裂解混合物通过基因组DNA清除柱，基因组DNA被清除而RNA（包括microRNA）被选择性洗脱滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列特殊漂洗液快速的漂洗－离心的步骤,将细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的RNase free H20将纯净RNA（包括microRNA）从硅基质膜上洗脱。

产品特点

1.完全不使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

2.快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。

3.独有的植物RNA助提剂可以有效结合多糖多酚,提高清除效果。

4.多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.9～2.0，可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

运输和保存方法

1）本试剂盒在室温储存6个月不影响使用效果。

2）所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。

3）不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。

4）Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用就可以。

5）避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

注意事项

1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2.需要自备乙醇， β-巯基乙醇，一次性注射器（可选），研钵。

3.样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。

4.裂解液RLT和RLT Plus 和Wash Solution 1中含有刺激性化合物，操作时戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

5.关于DNA 的微量残留:

一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留（DNase消化也无法做到100%无残留），该产品由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，个别特殊情况需要清除微量基因组DNA残留，我们建议直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。

6.RNA 纯度及浓度检测:  

完整性： RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA，电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb，分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。

纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。

浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40。

7.本产品仅作科研用途！

使用方法

提示：

→第一次使用前请先在Wash Solution 1和Wash Solution 2/3瓶加入指定量无水乙醇!

1.直接研磨法（推荐）:

1)新鲜植物组织称重后取100mg迅速剪成小块放入研钵（冰冻保存或者液氮保存样品可直接称重后取100mg放入研钵）， 加入10体积（1ml）RLT Plus和1体积（100μl）PLANTaid 室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液RLT立刻充分接触以抑制RNA酶活性。

注：PLANTaid是提取多糖多酚次级代谢产物色素含量丰富的困难样品不可缺少成分。提取普通植物组织可以不加PLANTaid，RNA产量可能会提高一些。

2)将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡15秒，13，000rpm离心5-10分钟，沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid。

3)取450μl裂解物上清（不要超过基因组DNA清除柱能力，如残留基因组DNA较多，可适当减少取上清量）将裂解物上清加到DNA清除柱上（清除柱放在收集管内）。

立刻接操作步骤项下3。

2.液氮研磨法:

1)取500μl裂解液RLT Plus，转入1.5ml离心管中，加50μl PLANTaid混匀备用。

液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取50mg细粉转入上述装有RLT和PLANTaid的离心管,  立即用手剧烈振荡20秒，充分裂解。

2)在56℃温育1-3分钟有助于裂解植物,但是淀粉含量高的植物不能温育,因为提高的温度可能导致淀粉膨胀。

3)用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9mm针头) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。

4)将裂解物13，000rpm离心5-10分钟,沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid。

5)取裂解物上清（不要超过基因组DNA清除柱能力，如残留基因组DNA较多，可适当减少取上清量）将裂解物上清加到DNA清除柱上（清除柱放在收集管内）。

立刻接操作步骤项下3。

3.立即13,000 rpm离心60秒，收集滤液（RNA在滤液中）。

a.用微量移液器较精确估计滤过液体积（450μl左右，滤过时候损失体积应该减去），加入1.25倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

b.立刻将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心30秒，弃掉废液。

c.加700μl Wash Solution 1（请先检查是否已加入无水乙醇!）12,000rpm 离心30秒,弃掉废液。

d.加入500μl Wash Solution 2/3（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl Wash Solution 2/3，重复一遍。

e.将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

f.取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。

得到的RNA可以立即用于下游反应或者尽快置于低温保存。