价格:3,200
货号miRNA逆转录荧光定量PCR检测试剂盒 HRbio™ miRNA RT-qPCR Detection Kit
产品详情
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产品信息
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产品名称 |
产品编号 |
规格 |
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HRbio™ miRNA RT-qPCR Detection Kit HRbio™ miRNA逆转录荧光定量PCR检测试剂盒 |
HRF0721 |
25次逆转录+500次qPCR反应 |
产品描述
本产品HRbio™ miRNA RT-qPCR Detection Kit包含miRNA检测的全部试剂。本制品采用Poly（A）加尾法，以miRNA为模板，采用特殊优化预混合miRNA RT Enzyme mix（包含 Poly(A)加尾酶和逆转录酶）将 Poly(A)加尾和逆转录一步法高效完成cDNA 合成；miRNA检测使用 2×miRNA qPCR Mix。适用于Total RNA或者small RNA等包含 miRNA 的样品。
产品特点
1.最佳的 Poly(A)加尾酶和反转录酶配比及优化的反应buffer，确保miRNA 的逆转录效率。
2.PolyA 加尾和逆转录cDNA合成在同一管内一步法完成。
3.2×miRNA qPCR Mix 扩增效率高，特异性强和灵敏度高。
4.配套ROX Reference Dye，可以用于各种需要高低 ROX 参比染料的机型。
产品组分
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编号 |
组分 |
HRF0721（25T） |
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HRF072-A |
miRNA RT Enzyme Mix |
50 μL |
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HRF072-B |
2×miRT Reaction Mix |
250 μL |
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HRF072-C |
Reverse primer(10μM ) |
200 μL |
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HRF072-D |
2 ×miRNAqPCR Mix(With SYBR Green) |
5mL |
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HRF072-E |
ROX Reference Dye |
100 μL |
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HRF072-F |
RNase free H2O |
1 mL |
运输和保存方法
干冰运输。-20℃保存，避免反复冻融，有效期1年。
使用方法
一、miRNA 3’末端进行Poly (A)加尾和逆转录反应（第一链合成）
1.解冻2×miRNA RT Reaction Mix并混匀，miRT Enzyme Mix放于冰中备用，加入以下试剂至总体积20μl(注意：最后加入miRNA RT Enzyme Mix)
| 组分 | 体积 | 终浓度 |
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Total RNA （见注意事项） |
x μL |
Up to 2μg |
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2 ×miRNA RT Reaction Mix |
10 μL |
1× |
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miRNA RT Enzyme Mix |
2 μL（见注意事项） |
- |
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加RNase free H2O补足到 |
20 μL | - |
2.移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在42°C反应60 min。
3.85°C加热5秒钟失活miRNA RT Enzyme Mix。
4.合成的cDNA反应液可放置于-20°C保存；也可以直接进行下游PCR或者荧光定量PCR检测。
注意事项
1.miRNA RT Enzyme Mix比较粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用前请点甩离心，并且避免吸头外壁沾附损失。Enzyme Mix内酶都是过量的，即使每次按照 1.8μl使用，也不影响使用效果。
2.在反应中使用的total RNA 必须包含有小分子RNA(miRNA)。此过程也可以使用富集的miRNA， 单纯miRNA无法直接用分光光度计定量，建议直接加入2μl ~5μl。可根据目的miRNA丰度决定加入量，但是对于低丰度miRNA 样品而言(如血清血浆提取物)，可直接加入最大体积8 μl。
3.按照上述操作步骤得到的cDNA模板用于下游PCR或者荧光定量PCR检测时，可以根据实际情况选择使用量，对于特殊的检测体系中，高含量的cDNA 模板易导致非特异性扩增，可根据所检测miRNA 的丰度适当的稀释cDNA（5-10倍或者100倍）后使用。如果发现有非特异扩增条带，或者溶解曲线显示有非特异扩增，往往提示cDNA模板过量， 可以尝试将上述cDNA模板稀释几十到几百倍甚至上千倍再使用。
4、本产品仅作科研用途！
二、 进行荧光定量PCR检测。
上游引物设计指南
1.遵循引物设计的普遍原则。
2.以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T，这是最基础的设计方法。
3.本试剂盒中提供的下游引物的Tm值为65℃，设计上游引物的Tm值尽量保证在65℃左右。
4.若按照原则2的方式直接设计的引物其Tm值过低，可以在引物的5’端添加几个碱基（最好为G或者C碱基）；也可以在3’端添加1个或者几个A碱基；或者5’端和3’端同时修饰。
5.若按照原则2设计的方式直接设计的引物，其Tm值过高，可以在引物的5’或者3’端去掉几个碱基。
注意事项
1.miRNA第一链cDNA的加入量不要超过qPCR体积的1/10。
2.对于特殊的检测体系中，高含量的cDNA模板易导致非特异性扩增，根据所检测miRNA的丰度适当的稀释cDNA（10倍或者100倍）。使用富集的miRNA做起始模板，可降低非特异扩增，提升敏感度。
3.本品中含有SYBR Green I，保存本品或者配制PCR反应液时应避免强光直接照射。
4.2×miRNA qPCR mix不含参比染料ROX，使用者应该根据机器的型号决定是否添加ROX参比染料，以达到消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号差。
操作步骤
1.在室温融化2×miRNA qPCR Mix(with SYBR Green I)和Reverse primer（10μM）
2.使用时请将2×miRNA qPCR Mix(with SYBR Green I)上下颠倒轻轻混匀，避免气泡，并经轻微离心后使用。如果试剂没有混匀，其反应性能可能会有所下降。请不要使用振荡器混匀！
3.按照下表组分冰上配制反应液
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组分 |
体积（μL） |
体积（μL） |
终浓度 |
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2×miRNA qPCR Mix |
25 |
10 |
1× |
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Forward Primer (10 μM) |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
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Reverse Primer (10 μM) |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
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miRNA第一链cDNA模板 |
X |
X |
- |
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无菌超纯水 |
To 50 |
To 20 |
- |
【注】： 使用前务必充分混匀， 避免剧烈震荡产生过多气泡。
a) 引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在 0.1- 1.0 μM 之间进行调整。
b) 模板浓度：如模板类型为未稀释 cDNA 原液，使用体积不应超过 qPCR 反应总体积的 1/10。
c) 模板稀释：cDNA 原液建议 5- 10 倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的 CT 值在 20-30 个循环为好。
d) 反应体系：推荐使用20 μL 或 50 μL ，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
e) 体系配制：请于超净工作台内配制， 并使用无核酸酶残留的枪头、反应管； 推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染 和气溶胶污染。
扩增程序 （两步法）
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循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
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预变性 |
94℃ |
2-3 min |
1 |
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变性 |
94℃ |
15-20 sec |
35-45 |
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退火/延伸 |
60℃ |
40 sec★ |
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熔解曲线阶段 |
仪器默认设置 1 |
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扩增程序 （三步法）
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循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
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预变性 |
94℃ |
2-3 min |
1 |
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变性 |
94℃ |
10-20sec |
35-45 |
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退火 |
55-60℃ |
10-20 sec |
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延伸 |
72℃ |
20-60 sec★ |
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熔解曲线阶段 |
仪器默认设置 1 |
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【注】高特异性可选择两步法，高效率扩增可选择三步法。
a) 预变性时间： 根据不同模板和引物的具体情况可适当缩短至 2 min。
b) 退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。
c) 荧光信号采集（★）：请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：
30sec 以上： Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96
31sec 以上： Applied Biosystems: 7300
34sec 以上： Applied Biosystems: 7500
d) 熔解曲线： 通常情况下可以使用仪器默认程序。