• 说明书丨HRX1051-Cell+Counting+Kit-8+(CCK-8).pdf

产品信息

检测原理

Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

WST-8属于MTT的升级产品，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。

CCK-8法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。

应用

1) 细胞增殖测定 - CCK-8是水溶性的，在培养中是稳定的，并且是无毒的。

2) 细胞活力测定 - 代谢活性和染料产生与改变的活力成比例地变化。

3) 细胞因子测定 - 测量细胞因子诱导的增殖。如果需要，可以在研究结束时回收细胞并扩增。

4) 细胞毒性测定 - 来自细胞毒性化学物质的细胞死亡对颜色发展没有影响，只有活细胞将试剂转化为比色指示剂。试剂本身具有可忽略的毒性，并且通常对细胞是安全的。

使用方法

细胞数量确定

1.将细胞悬浮液（100μL/孔）接种在 96 洞孔板中。将板在潮湿的培养箱中预孵育（例如，在 37℃，5％CO₂ 下）。

2.向板的每个孔中加入 10μLCCK-8 溶液。注意不要在孔洞中引入气泡，因为它们会干扰 OD读数。

3.将培养板在培养箱中孵育 1-4 小时。

4.使用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度。

细胞增殖和细胞毒性测定

1.将种子细胞以10³-10⁴个细胞/孔的密度在 96 孔板中在 100μL 培养基中培养，含有或不含有待测化合物。将细胞在 CO₂ 培养箱中于 37℃培养 24 小时。

2.将 10μL 不同浓度的待测物质加入板中。

3.将培养板在培养箱中孵育适当的时间（例如，6,12,24 或 48 小时）。

4.使用重复移液器向板的每个孔中加入 10μLCCK-8 溶液。注意不要在孔洞中引入气泡，因为它们会干扰 O.D.读数。

5.将培养板在培养箱中孵育 1-4 小时。

6.在读取印版之前，重要的是在轨道振动器上轻轻混合 1 分钟，以确保颜色均匀分布。

7.使用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度。

数据分析

统计分析有几种方法，您可以选择使用 OD值或细胞数量，我们提供其中一种方法。

细胞存活率（％）= [（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100

抑制率（％）= [（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100

As =实验孔吸光度（含有细胞，培养基，CCK-8 和待测化合物的孔的吸光度）。

Ab =空白孔吸光度（含有培养基和 CCK-8 的孔的吸光度）。

Ac =对照孔吸光度（含有细胞，培养基和 CCK-8 的孔的吸光度）。

制作标准曲线

1.细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数。

2.使用培养基，等比稀释细胞悬液为一个浓度梯度，通常需要 5-7 个浓度梯度，每组几个复孔。然后接种细胞。（注意每孔的细胞数量。如果您将细胞悬液稀释在管中，在加入培养板的孔之前，请小心再次混匀细胞。每孔中细胞悬液的体积应该是一致的。）

3.培养直至细胞贴壁（通常 2-4 小时），然后每 100 μL 培养基加入 10 μL CCK-8。继续孵育 1-4 小时，用酶标仪测量 450nm 处的吸光度。制作出一条以细胞数为 X 轴坐标，OD值为 Y 轴坐标的标准曲线。可以基于该曲线确定待测样品的细胞数。使用此标准曲线的先决条件是培养检测条件相同。

保存条件

4℃避光保存，有效期一年（推荐）。-20℃干燥避光保存，有效期二年。

CCK-8方法和优势

1） 表1 CCK-8法与其他细胞增殖/毒性检测方法的优势比较

2） 酚红和血清对CCK-8法的检测不会造成干扰；

3） 细胞毒性非常低，因此加入WST-8显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读数从而找到最佳测定时间。

注意事项

1）确保药物和 CCK-8 均匀分布在培养基中。

2）细胞增殖越多, 颜色越深; 细胞毒性越强，颜色越浅。

3）对于贴壁细胞，每孔至少需要 1000 个细胞（100 μL 培养基）。对于白细胞，由于灵敏度较低，每孔至少需要 2500 个细胞（100 μL培养基）。推荐的 96 孔板每孔最大细胞数为 25000。如果使用 24 孔或 6 孔板进行该检测，请计算相应的每孔的细胞数，并调整CCK-8 的体积，使其为每孔总液体体积的 10％。

4）因为 CCK-8 测定是基于活细胞中的脱氢酶活性，影响脱氢酶活性的条件或化学物质可能导致实际活细胞数与使用 CCK-8 测定活细胞数之间有差异。

5）WST-8 可能与还原剂反应生成 WST-8 formazan。如果使用还原剂 (例如一些抗氧化剂)会干扰检测。如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。

6）孵育 2 小时后，背景 OD值一般为 0.1-0.2 单位。

7）注意不要在孔中引入气泡，因为它们会干扰 OD值。

8）如果您想对 CCK-8 溶液进行灭菌，请使用 0.2 μm 的膜过滤溶液。

9）孵育时间因孔中细胞的类型和数量而异。通常，白细胞着色较弱，因此可能需要较长的孵育时间（长达 4 小时）或大量细胞（~10⁵细胞/孔）。

10）如果细胞悬液中存在高浊度, 测量并减去样品在 600nm 或更高波长的 O.D 值。

11）CCK-8 不能用于细胞染色。

12）培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

13）CCK-8 的毒性非常低，在 CCK-8 测定完成后，相同的细胞可用于其他细胞增殖测定，例如结晶紫测定，中性红测定或 DNA 荧光测定。（除非细胞极为稀少，不推荐。）

14）该试剂盒可用于大肠杆菌，但不能用于酵母细胞。

15）在读取平板之前，您可以在摇床上轻柔混匀。

16）我们建议将细胞接种在靠近培养板中央的孔中，最外围一圈孔中的培养基容易蒸发，可以用 PBS，水或培养基填充这些孔。

17）如果您没有 450 nm 滤光片。您也可以使用吸光度在 430 和 490 nm 之间的滤光片, 450 nm 滤光片具有最佳灵敏度。

18）测量 450 nm 处的吸光度，如果您需要进行双波长测定，作为参考波长可以测定 650 nm 处的吸光度。

19）药物中金属离子的存在可能会影响 CCK-8 的灵敏度。终浓度为 1 mM 的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5% 、15% 、90% 的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是 10 mM 的话，将会 100% 抑制。

20）本产品仅作科研用途！