4-香豆酸:辅酶A连接酶( 4-coumarate:CoA ligase,4CL)试剂盒

4-香豆酸:辅酶A连接酶( 4-coumarate:CoA ligase,4CL)试剂盒

价格:2,250

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产品信息

 

产品名称

测定方法

产品编号

规格

4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)

试剂盒

分光光度法

HRK2813

50管/24样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

 

测定意义

 

4CL是连接苯丙酸途径与木质素特异合成途径的关键酶,主要催化肉桂酸生成相应的肉桂酸辅酶A酯,是合成木质素与其他苯丙烷类化合物的代谢流向调控点。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中,研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理,为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。

 

测定原理

 

4CL催化4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA,在333nm下测4-香豆酸CoA生成速率,即可反映4CL活性。

 

需自备的仪器和用品

 

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

 

试剂的组成和配制

 

提取液:60mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体60 mL×1瓶, 4℃保存;

试剂二:粉剂×2瓶,-20℃保存;

 

粗酶液提取

 

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

 

测定步骤

 

1.分光光度计40预热30min以上,调节波长至333nm,蒸馏水调零。

2.样本测定

(1)在试剂二中加入12.5mL试剂一充分溶解混匀,置于40℃水浴预热10min;现配现用(配好后24h内用完)

(2) 测定管:在1mL石英比色皿中加入50μL样本和950μL试剂二,混匀,立即记录333nm处40℃反应30min后的吸光值A2。

     对照管:在1mL石英比色皿中加入50μL样本和950μL试剂一,混匀,立即记录333nm处40℃反应30min后的吸光值A1,计算ΔA=A2-A1。

注意:每个测定管设一个对照管。

 

4CL活性计算

 

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。

4CL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=31.75×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位定义:每g组织每分钟生成1 nmol 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。

4CL(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=31.75×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。

4CL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.063×ΔA

V反总:反应体系总体积,1×10-3 L;ε:4-香豆酸辅酶A摩尔消光系数,2.1×104 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.05 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

注意事项

本产品仅作科研用途!

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