价格:3,000
货号4-香豆酸:辅酶A连接酶( 4-coumarate:CoA ligase,4CL)试剂盒
产品详情
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产品信息
产品名称 |
测定方法 |
产品编号 |
规格 |
4-香豆酸:辅酶A连接酶( 4CL)试剂盒 |
微量法 |
HRK2812 |
100管/48样 |
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
4CL是连接苯丙酸途径与木质素特异合成途径的关键酶,主要催化肉桂酸生成相应的肉桂酸辅酶A酯,是合成木质素与其他苯丙烷类化合物的代谢流向调控点。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中,研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理,为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。
测定原理
4CL催化4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA,在333nm下测4-香豆酸CoA生成速率,即可反映4CL活性。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体25 mL×1瓶, 4℃保存;
试剂二:粉剂×2瓶,-20℃保存;
粗酶液提取
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤
1.分光光度计或酶标仪40℃预热30min以上,调节波长至333nm,蒸馏水调零。
2.准备96孔UV板一块(非普通酶标板,普通酶标板只能透过可见光,不能透过紫外光,检测波长小于340nm务必使用UV板)。
3.样本测定
(1)在试剂二中加入5mL试剂一充分溶解混匀,置于40℃水浴预热10min;现配现用(配好后24h内用完);
(2)对照管:在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL样本和190μL试剂一,混匀,立即记录333nm处40℃反应30min后的吸光值A1。
(3)测定管:在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL样本和190μL试剂二,混匀,立即记录333nm处40℃反应30min后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。每个测定管设一个对照管。
4CL活性计算
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=31.75×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位定义:每g组织每分钟生成1 nmol 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=31.75×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.063×ΔA
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:4-香豆酸辅酶A摩尔消光系数,2.1×104 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=63.49×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=63.49×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.127×ΔA
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:4-香豆酸辅酶A摩尔消光系数,2.1×104 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
注意事项
本产品仅作科研用途!