Plant Tissue PCR Kit (With Dye)植物组织直接PCR试剂盒

Plant Tissue PCR Kit (With Dye)植物组织直接PCR试剂盒

价格:700

货号

产品详情

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产品信息

 

产品名称

产品编号

规格

价格(元)

Plant Tissue Direct PCR   Kit  (With Dye)

HRF0241

100 T

700.00

Plant Tissue Direct PCR   Kit  (With Dye)

HRF0252

200 T

1200.00

 

产品描述

 

植物组织直接PCR试剂盒是一款可直接对不同类型植物叶片进行PCR扩增的试剂盒,适应性广、稳定性强。试剂盒采用独特的裂解缓冲液体系,可以快速的裂解多种植物样品并释放出基因组DNA,不需要除去蛋白、RNA或次生代谢产物等,即可将释放出的基因组DNA作为模板直接用于PCR反应。此外,样品使用量少,低至1 mm植物叶片即可进行实验。

本试剂盒中提供的Plant Master Mix具有很强的扩增兼容性,能直接以待测样品裂解液为模板,进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液,包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分,大大简化操作过程,降低污染几率。

该试剂盒可用于转基因植株鉴定、植物基因分型等。

 

产品组分

 

类别

编号

组分

产品编号/规格

储存

HRF0241(100 T

HRF0242(200 T

Part I

HRF024-A

Buffer P1

1.25   mL × 2

5 mL × 2

4℃

HRF024-B

Buffer P2

500 μL

1 mL × 2

4℃

Part II

HRF024-C

2× Plant   Master Mixa

500 μL

1 mL × 2

-20℃

 

a2× Plant Master Mix包含热启动Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等,同时包含电泳Loading Buffer, PCR完成之后可直接电泳。

 

运输方法

 

冰袋运输。

 

保存方法

 

1. 试剂HRF024-A【Buffer P1】,置于4℃保存。有效期1年。

2. 试剂HRF024-B【Buffer P2】,中和裂解产物,利于更长时间保存样本,置于4℃保存。有效期1年。

3. 试剂HRF024-C【2 × Plant Master Mix】,-20℃保存,避免反复冻融。有效期1年。

 

操作方法

 

植物叶片——研磨裂解法

 

①研磨仪破碎:将直径5 mm左右的叶片置于50 μL Buffer P1中,用研磨仪加钢珠(钢珠直径3mm左右,共2个)破碎叶片(45 Hz1 min),叶片破碎后溶液呈现绿色,瞬时离心,上清液请放在4℃备用,取1 μL用于PCR扩增。

枪头捣碎:推荐使用幼嫩叶片。将直径5 mm左右的叶片置于50 μL Buffer P1中,用枪头将叶片捣碎,捣碎后溶液呈现绿色,瞬时离心,上清液请放在4℃备用,取1 μL用于PCR扩增。


加热裂解法
:推荐使用幼嫩叶片。将直径5 mm左右的叶片置于50 μL Buffer P1中,95℃加热5-10 min(确保裂解液完全浸没叶片),较难裂解的叶片(老叶片)可适当延长时间(10-20 min),加热裂解后溶液呈现绿色,震荡混匀,瞬时离心,上清液请放在4℃备用,取1 μL用于PCR扩增。


直接法:
推荐使用幼嫩叶片。使用打孔器或者刀,将直径1 mm左右的叶片直接加入到PCR
反应体系中;复杂样本或者是长片段的扩增,推荐使用直径<1 mm的叶片。

 

PCR反应体系

 

组分

体积(μL

体积(μL

终浓度

2× Plant Master Mix

10

25

Forward Primer (10 μM)

0.5

1

0.2-0.25 μM

Reverse Primer (10 μM)

0.5

1

0.2-0.25 μM

裂解产物(DNA模板)

1

2

-

ddH2O

To 20

To 50

-

 

【注】:各组分使用前应充分混匀。

a模板加入量:小于PCR反应体系的5%,过多会严重抑制PCR反应,强烈推荐加入1 μL模板。叶片直扩优先推荐研磨仪裂解法。

b引物终浓度0.2-0.25 μM可以得到较好结果。反应性能较差时,可在0.1-0.5 μM范围内调整引物浓度。

c反应体系:推荐使用20 μL50 μL,以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

d体系配制:配制好PCR反应体系,置于涡旋仪上涡旋混匀,瞬时离心将反应液集于管底。

e对照反应:建议进行PCR时,设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。

f为了更稳定的保存裂解后的模板,将转移出来的上清液,按照裂解产物(DNA模板):Buffer P2 = 5:1的比例混合,混匀后-20℃保存,稳定保存随时间和样本状态不同而有所不同。如果处理后的植物叶片上清液一周内用于PCR扩增,不用加Buffer P2,上清液请保存在-20

 

PCR反应条件

 

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

94℃

5 min

1

变性

94℃

10 sec

35

退火

50-65℃

20 sec

延伸

72℃

1 min

终延伸

72℃

5 min

1

 

【注】

      a退火温度:请参考引物的理论 Tm 值,退火温度可设置低于引物理论值 2-5℃

      b延伸时间:需要根据片段的长度来确定,对于1 kb以内的DNA片段,建议延长时间为1 min

 

注意事项

 

1.  做叶片实验时,建议使用新鲜采取的叶片组织,若为长期冷冻组织,需-80℃保存,应尽量避免反复冻融,以免造成模板降解,影响PCR效率。叶片组织以幼嫩为宜,若为成熟的叶片,避免使用叶片主脉部位组织。

2. 建议扩增片段长度1 kb以内,以便扩增效率最佳。

3. 取样时使用打孔器或者刀取适宜大小的样本,样本不同时,打孔器或者刀每次处理样本前需清洗干净。

4. 对于叶片组织,建议取1-10 mm的叶片,过小会使PCR扩增产量低,过多会抑制PCR反应,采用加热裂解法、枪头捣

碎、研磨仪破碎的方式处理植物叶片,处理后需震荡离心,务必取上清液试验,沉淀会严重抑制PCR反应。

5. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

6. 本产品仅作科研用途!

 

常见问题与解决方法

 

常见问题

可能原因

解决方法

阳性对照、待测样本均无条带。

PCR反应体系或反应条件不合适。

使用梯度PCR摸索PCR最佳反应条件。

PCR试剂保存不当失去活性。

2× PCR Mix应保存于-20℃,使用时避免反复冻融。若使用频繁,可在4℃短时间存放。

引物设计问题。

尝试重新设计引物进行检查。

阳性对照有目的条带,待测样本无条带或条带弱。

裂解液、中和液加入比例不当,裂解混合液影响PCR体系的pH值。

正常条件下,中和后的裂解混合液的 pH 应该在7-8左右(裂解产物和Buffer P2严格按照5:1的量进行中和)

样本裂解混合液保存不当或保存时间过久,DNA基因组已经降解。

裂解混合液液可在4℃保存5天,尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR

模板加入量不适合。

在反应体系<5%范围内优化模板加入量。

PCR循环数不足。

适当增加PCR的循环数,推荐35-40循环为佳。因模板复杂,一般PCR反应要比用纯化的DNA模板多5-10个循环为佳。

非特异性扩增

PCR退火温度太低,循环数、引物浓度或模板浓度太高。

增加PCR退火温度,降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。

PCR引物错配。

重新设计PCR引物。

配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。

PCR反应体系的配制在低温下进行,配制完成后尽快进行PCR扩增反应。

阴性对照出现目的条带

操作工具或试剂污染。

实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

样本间交叉污染。

每个取样器只对一个样本使用;或取完一个样本后,将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中,反复涮洗,然后用干净的纸巾擦干残液。

 

 

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