• 说明书丨HRA1966-rac-Coelenterazine 400a 腔肠素400a.pdf

产品信息

背景描述

腔肠素（Coelenterazine）是自然界中资源最丰富的天然荧光素，是绝大多数海洋发光生物（超过75%）的光能贮存分子。腔肠素可作为许多荧光素酶的底物，比如海肾荧光素酶（Rluc），Gaussia分泌型荧光素酶（Gluc），以及包括水母发光蛋白（aequorin）和薮枝螅发光蛋白（Obelia）在内的光蛋白（Photoproteins）。其发光原理是：以腔肠素为底物的荧光素酶在有分子氧的条件下，氧化腔肠素，产生高能量的中间产物，并在此过程中发射蓝色光，峰值发射波长约为450~480 nm。

腔肠素作为水母发光蛋白复合物（Aequorin）的组成成分，只有与钙离子（Ca2+）结合后，才能被氧化生成高能量产物Coelenteramide，同时释放出CO2和蓝色荧光（~466 nm）。其具有以下几个优点：1）能检测较大范围的Ca2+浓度（0.1-100 μM）；2）样品无自体荧光，背景荧光较低，尽管信号较荧光钙离子指示剂弱，但信噪比更高，因此具有较高灵敏度；3）Aequorin能够稳定维持在细胞内，能够进行数小时至数天Ca2+的监测。

腔肠素具有能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET）的特性：在底物腔肠素存在的情况下，荧光素酶（如Rluc）催化底物发生蓝光，能量转移到EYFP（增强的黄色荧光蛋白），发出绿光（~530 nm）。通过Rluc融合蛋白和EYFP融合蛋白两者间的相互关系研究蛋白-蛋白之间的相互作用。BRET的信号可通过比较绿光和蓝光的量来进行测定，消减了因细胞数、细胞类型和其他实验变量而引起的数据变量。

主要应用

1. 活体成像。

2. 报告基因检测。

3. 检测细胞/组织内活性氧（ROS）水平：细胞和组织内的超氧阴离子和过氧化亚硝基阴离子能够增强腔肠素在酶非依赖性的氧化体系中自发荧光。

4. 高通量筛选。

5. 监测活细胞内钙离子水平。

产品描述

      腔肠素400a（Coelenterazine 400a）系天然腔肠素衍生物，是海肾荧光素酶（Rluc）的良好底物，但不能被Gaussia分泌型荧光素酶（Gluc）氧化。它的最大发射波长在400 nm左右，对GFP受体蛋白的信号干扰最小，使得其成为BRET研究的首选腔肠素类底物。

产品性质

运输和保存方法

冰袋运输。粉末-20℃避光干燥保存，最好保存在惰性气体环境下，避免接触空气。

腔肠素400a工作液的配制

      腔肠素400a溶解特性：不溶于水。目前毒性最低的溶剂是100%乙醇，可配制浓度为0.1-1 mg/ml。加入pH低于7.0的酸性缓冲液（碱性pH会快速降解底物）稀释成低浓度工作液。切忌溶于DMSO。

      腔肠素400a保存特性：建议溶液现配现用！体外实验，需将稀释后的工作液室温放置20-30 min，方可稳定工作。该工作液可室温稳定放置3-4 h，有非常微弱的信号衰减发生。不建议储存液-20℃或更低温度保存，因为其高能量的二氧环丁酮结构即使在低温的情况下也会发生降解，导致荧光强度明显变弱。短时间保存条件：-70℃避光保存于塑料管内（溶液中不含有Ca2+），且有惰性气体保护。

      腔肠素工作液的配制：称取1 mg腔肠素400a粉末溶解于1 ml乙醇（或甲醇）中配置成浓度为1 mg/ml的母液。用商业化的Rluc反应缓冲液稀释到300 M（如127 l母液+1 ml Rluc反应缓冲液）。然后取1.1 ml 300 M溶液加入到6.6 ml PBS中，混匀。

BRET 生物发光共振能量转移（可根据具体实验发生变动）

      详细步骤可参考文献：Gersting SW, et al. Bioluminescence resonance energy transfer:an emerging tool for the detection of protein-protein interaction in living cells. Methods Mol Biol. 815:253-63 (2012)。

      本步骤以Rluc的融合蛋白作为能量供体，YFP的融合蛋白作为能量受体，两者同时电转化进入细胞，并通过加载腔肠素400a底物来启动氧化反应，通过分析两者BRET信号来研究两个蛋白之间的相互作用。

      1. 按照正常流程将能表达两个融合蛋白的质粒，按照3:1的比例（YFP : Rluc）共电转染进入细胞。

      2. 转染后24 h进行BRET信号的检测。吸去培养液（留约30 μl）后，将96孔板放到荧光酶标仪上。

      3. 至少在测定前15 min准备腔肠素400a工作液。

      4. 用超纯水清洗注射泵后，让泵开始自动吸取配制好的400a工作液，按照每孔70 l工作液的量顺序加入，使得每孔中底物的终浓度为30 M。进样结束后，孵育2 min。之后立即进行双波长荧光信号读数，即Rluc信号（485 nm）和BRET信号（535 nm）。

BRET信号值计算

      为了能够进行数据评估，转染细胞的Rluc信号（485 nm）应当超过非转染对照细胞的（平均值+9×标准误差）的区间。

      1. BRET–ratio（BRET信号比）基于以下等式进行计算，

R=（IA/ID）-cf

      R代表BRET比值，ID表示受体YFP荧光信号的强度（535 nm），IA表示供体Rluc荧光信号的强度（485 nm），cf表示校准因子（BRETcontrol/Rluccontrol D），对照样本是指共转染YFP融合蛋白质粒和不含供体第二个研究蛋白的Rluc载体的细胞荧光信号。

      2. 阳性对照，使用YFP-Rluc融合蛋白的BRET比值为1.0。

      3. 若蛋白之间有阳性反应，必须检测到：8组蛋白样本中至少有一组能够产生超过设定阈值0.1以上的BRET信号比值。

注意事项

      1. 粉末最好使用惰性气体（氮气或氩气），在密封良好的塑料管中避光保存于-20℃，长期保存于-70℃。管内即使存在少量空气，可能造成腔肠素cp氧化失活，造成在不同试验间的量化分析结果无法比较。

      2. 本品接触空气，水或者任何氧化试剂会不稳定。

      3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

      4. 本产品仅作科研用途！