异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase,ICL)试剂盒

异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase,ICL)试剂盒

价格:800

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产品信息

 

产品名称

测定方法

产品编号

规格

异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase,ICL)试剂盒

分光光度法

HRK2815

50管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

 

测定意义

 

ICL(EC4.1.3.1)主要存在于植物和微生物中,油料作物种子在萌发过程中,通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物。ICL是乙醛酸循环的关键酶之一。

 

测定原理

 

ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸,乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD,NADH在340nm下有特征吸收峰,监测340nm吸光度的减小速率可间接反应ICL活性。

 

需自备的仪器和用品

 

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水

 

试剂组成和配制

 

提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体15mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:液体15mL×1瓶,4℃保存;

试剂三:粉剂×3瓶,-20℃保存;临用前每瓶加入5mL蒸馏水,充分混匀待用;用不完的试剂仍-20℃保存;

试剂四:粉剂×3瓶,-20℃保存;临用前每瓶加入5mL蒸馏水,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂五:液体800μL×2支,4℃保存;临用前每支加入560μL蒸馏水,充分混匀待用;用不完的试剂仍4℃保存;

试剂六:粉剂×3瓶,4℃保存;临用前每瓶加入5mL蒸馏水,充分混匀待用。用不完的试剂-20℃保存;

 

样本的前处理

 

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

 

测定步骤

 

试剂

测定管

试剂一(μL)

300

试剂二(μL)

250

试剂三(μL)

300

试剂四(μL)

300

试剂五(μL)

20

样本(μL)

50

混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min

试剂六(μL)

300

将上述试剂按顺序加入1 mL玻璃比色皿中,加试剂六的同时开始计时,在340nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和2分20秒时的吸光度A2,计算ΔA=A1-A2。

注意:若一次性测定样本较多,可将试剂一、二、三、四、五和样本按比例配成混合液,在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min以上,测定时加入1220µL混合液和300µL试剂六测定。

 

ICL活性计算

 

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白中每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ICL(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=2443×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ICL(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=2443×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ICL(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=4.886×ΔA

V反总:反应体系总体积,1.52×10-3 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.05 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

注意事项

本产品仅作科研用途!

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