• 说明书丨HRN0498-石蜡包埋组织RNA快速提取试剂盒.pdf

产品信息

产品描述

      本试剂盒设计用于快速从福尔马林固定、石蜡包埋组织样品中提取总RNA。独特的裂解液/蛋白酶K迅速裂解细胞释放出RNA，然后裂解混合物通过一个基因组DNA清除柱，基因组DNA被清除而RNA穿透滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase free H₂0将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。得到的RNA可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。

适用范围

适用于快速从福尔马林固定、石蜡包埋组织样品中提取总RNA，RNA可用于反转录PCR，荧光定量PCR。

产品特点

1、完全不使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
2、快速、简捷、单个样品RNA 提取操作一般可在1小时内完成。
3、试剂盒的独家基因组清除柱和配方确保有效清除基因组DNA残留，一般情况下得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。
4、多次柱漂洗确保RNA高纯度，可直接用于下游各种实验。

试剂盒组分

运输和保存方法

1）本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

2）所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。

3）为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后加入0.5毫升灭菌水溶解（终浓度40mg/ml）。因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分装冻存，-20℃保存

4）一些常温组分不适合放置低温（例如4℃或者-20℃），否则可能会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。

5）避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

注意事项

1、所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2、样品处理量绝对不要超过基因组DNA清除柱和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或者产量降低。不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大，例如胸腺脾脏DNA含量丰富，超过5mg就会超过柱子处理能力。COS细胞RNA含量丰富，超过3x106细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品 DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，如不超过2个10μm厚度石蜡切片。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
3、裂解液PKD、结合液RBC中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4、预防RNase 污染，应注意以下几方面：
      ⑴.经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
      ⑵.使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
      ⑶.RNA提取过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
      ⑷.配制溶液应使用无 RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入 DEPC 至终浓度 0.1%( v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）
5、关于DNA 的微量残留：
      一般说来任何总 RNA 提取试剂在提取过程中无法完全避免 DNA 的微量残留（DNase 消化也无法做到 100%无残留），本固定包埋组织 RNA快速提取试剂盒，由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组 DNA 清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA 含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA 表达量分析荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：选用跨内含子的引物，以穿过 mRNA 中的连接区，这样 DNA 就不能作为模板参与扩增反应。选择基因组DNA 和 cDNA 上扩增的产物大小不一样的引物对。
6、RNA 纯度及浓度检测：
      完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE 电泳缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于石蜡包埋组织福尔马林固定和包埋过程中一般由于 RNA 与蛋白反应交联会导致 RNA 断裂或者降解，一般电泳后 UV 下只能看到模糊弥散（smear）带型，随着储存的时间越长，降解断裂越严重，甚至只能看到峰值仅仅在 100bp 左右的模糊条带。这都属于 RNA 提取正常情况。
      纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的RNA， OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7.5）在 1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的 pH 值影响。同一个 RNA 样品，假定在 10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数 1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在 1.5-1.9之间，但这并不表示 RNA 不纯。
      浓度：取一定量的 RNA 提取物，用 RNase-free水稀释 n 倍，用 RNase-free 水将分光光度计调零，取稀释液进行 OD260、OD280 测定，按照以下公式进行 RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数 n)×40。

7.本产品仅作科研用途！

使用方法

实验前请先阅读注意事项
第一次使用前请先在漂洗液RW 瓶中加入指定量无水乙醇。
1、修整去除过量包埋组织外石蜡，并切片成5-20μm 厚切片（开始的2-3 片抛弃不用）。
2、收集总厚度不超过■40μm 的石蜡切片到一个1.5-2ml 离心管（例如 2 片 20μm、 4 片 10μm、8 片 5μm 的石蜡切片），或者不超过▲80μm 的石蜡切片到一个 2ml离心管。
3、■代表处理切片总厚度≤40μm，▲代表处理切片总厚度≤80μm
4、加入 1ml 100%二甲苯，涡旋振荡 10 秒。瞬间离心把组织全部浸入到二甲苯。
5、50℃水浴 3 分钟熔解石蜡，20-25℃最高速离心 2 分钟，收集组织到管底。
6、小心用移液器吸弃上清二甲苯，注意不要吸到沉淀。
7、加入 1ml 无水乙醇，涡旋振荡，最高速离心 2 分钟，小心吸弃上清乙醇。
8、加入 1ml 无水乙醇，重复步骤 6 一遍，尽可能吸弃所有乙醇。
9、室温或者 37℃ 晾干乙醇 10 分钟或直到所有乙醇挥发干。
      乙醇完全晾干非常重要，微量的乙醇残留也会导致 RNA 产量降低。
10、重悬吹打或者涡旋振荡充分重悬组织沉淀在■150μl ▲240μl 裂解液 PKD 中，短暂离心收集液体到管底，加 10μl 蛋白酶K，吹打混匀。
11、55℃孵育 15 分钟，然后 80 ℃孵育 15 分钟。
      55℃孵育后，可以将离心管取出放置在室温，等水浴锅温度升到 80℃后再放入水浴锅，精确的孵育 15 分钟。即使 2 分钟的延长也可能导致 RNA 的部分降解。
12、加入■320μl ▲500μl 结合液RBC，充分吹打混匀调节结合条件。
13、立刻将混合物加入一个基因组 DNA 清除柱中，（清除柱放入收集管中）14,000 rpm离心 60 秒，保留滤过液（RNA 在滤过液中）。
       应避免吸到可能有的较大的未消化完全的絮团物质上柱子，以免堵塞离心柱。
14、加入■720μl ▲1200μl 无水乙醇到滤过液中，立即吹打混匀，不要离心。
15、立刻将混合物(每次小于 700μl，多可以分多次加入)加入一个 RNA 吸附柱RA 中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm 离心 30 秒，弃掉废液。
16、加入 500μl 漂洗液 RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心 30 秒，弃掉废液。加入 500μl 漂洗液 RW，重复一遍。
17、将吸附柱 RA 放回空收集管中，13,000 rpm 离心 2 分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
18、取出吸附柱 RA，放入一个 RNase free 离心管中，根据预期 RNA 产量在吸附膜的中间部位加 30μl RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加热可提高产量）， 室温放置 1 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟。
      洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要 RNA 浓度较高，可以适当减少洗脱体积，如果需要 RNA 浓度高，可以将洗脱液放回吸附柱 RA，再洗脱一遍。