• 乙酸激酶说明书(微量法)HRK2816.pdf

产品信息

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定 

测定意义

ACK 主要存在于微生物中，催化乙酸和 ATP 生成乙酰磷酸和 ADP，是细菌碳代谢和能量代谢的关键酶，尤其是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。

测定原理

（1）ACK 催化乙酸钠和 ATP 生成乙酰磷酸和 ADP，（2）丙酮酸激酶催化 ADP 和 PEP 生 成 ATP 和丙酮酸，（3）乳酸脱氢酶催化丙酮酸和 NADH 生成乳酸和 NAD⁺，（4）在 340nm下测定 NADH 氧化生成 NAD⁺速率，即可反映 ACK 活性。

需自备的仪器和用品

外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制 

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 30mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×2 瓶，-20℃保存；

试剂三：液体 500μL×1 支，4℃保存；

样本的前处理

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定

（1）工作液的配置：临用前取试剂二一瓶，加入 10mL 试剂一和 200μL 试剂三，充分混合溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；现配现用；

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL样本和180μL工作液，混匀，立即记录340nm处 20s 时的吸光值 A1 和 3min20s 后的吸光值 A2，计算ΔA=A1-A2。

ACK活性计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

ACK（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=536×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

ACK（nmol/min /g 鲜重）= [ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=536×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

ACK（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=1.072×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，3 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

ACK（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=1072×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

ACK（nmol/min /g 鲜重）= [ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=1072×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

ACK（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=2.144×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：96

孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，3 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

注意事项

本产品仅作科研用途！