• 说明书丨HRX1329-JC-1 线粒体膜电位荧光探针.pdf

产品信息

产品描述

JC-1 是一种广泛用于检测线粒体膜电△Ψm位的理想荧光探针。JC-1染料以电势依赖性的方式积聚在线粒体内，可以用来检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光（Ex=585 nm, Em=590 nm）；不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失，JC-1只能以单体的形式存在于胞浆中，产生绿色荧光（Ex=514 nm, Em=529 nm）。JC-1不仅可用于定性检测，因颜色的变化可以非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。也可以用于定量检测，因线粒体的去极化程度可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量。观察时，只需使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可。

JC-1 用于检测细胞的线粒体膜电位时常用的浓度范围为 1～20 g/mL，对于很多细胞适宜采用的 JC-1浓度为 10 g/mL。

产品性质

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。

粉末-20℃干燥避光保存，至少一年有效。储存液分装成单次使用量，-20℃干燥避光保存，避免反复冻融，约一年有效。

使用方法

1. 工作液配制：

1）JC-1粉末（5 mg）：直接加1 mL DMSO到粉末内，室温颠倒混匀使其充分溶解，即得到5 mg/mL的储存液。溶液分装成小量储存于-20℃，避光干燥，避免反复冻融。

2）JC-1储存液（1 mg in DMSO）：本品是JC-1的DMSO储存液，浓度为5 mg/mL。使用者需要根据单次用量来分装，-20℃避光干燥，避免反复冻融。

3）工作液配制：将冻存的储存液置于室温充分融化，之后用缓冲液或者预热的培养基直接稀释储存液（5 mg/mL）到需要的工作液浓度，边震荡边稀释，充分混匀。为了去除任何不溶颗粒，建议13,000 x g离心JC-1工作液1 min，小心吸取上清转移到新的管子内。整个过程要避光操作。注意：因JC-1不溶于水，很可能在稀释到工作液的过程中形成聚集颗粒，则建议细胞染色前用离心或者过滤的方法去除这些颗粒后再使用。

2. JC-1染色步骤（流式细胞仪）

1）于6-，12或24-孔板上进行细胞铺板，密度为5×105 cells/mL。37℃，5%CO2培养箱培养过夜。选择合适的化合物根据特定的步骤进行凋亡诱导。 注：进行凋亡诱导时的细胞密度建议不超过1×106 cells/mL，也可根据自己的细胞类型培养至合适的密度。

2）取0.5 mL细胞悬液至无菌的离心管内；

3）室温条件400 x g离心5 min；吸掉上清。

4）用0.5 mL JC-1工作液重悬细胞，于37℃，5%CO2培养箱孵育15-30 min；注意：一般情况，15 min足以进行充分的染色。

5）室温条件400 x g离心5 min；吸掉上清；

6）用2 mL细胞培养液或者缓冲液重悬细胞，之后室温条件400 x g离心5 min；吸掉上清；

7）重复步骤6）；

8）用0.5 mL新鲜培养液或者缓冲液重悬细胞，即可进行后续的流式分析。注意：请马上进行流式定量分析，此细节很重要。

数据分析：含有红色JC-1聚集物的健康细胞线粒体用FL2通道检测；含有绿色JC-1单体的凋亡或不健康细胞用FL1（FITC）通道检测。

3.  JC-1染色步骤（荧光显微镜）

A． 悬浮细胞

1）-6）同上JC-1染色步骤（流式细胞仪）；

7）用0.3 mL的缓冲液重悬细胞，即可进行荧光显微镜检测。注意：请马上进行荧光显微分析，此细节重要。
      数据分析：使用可同时检测荧光素fluorescein/罗丹明或者荧光素fluorescein/Texas Red的双带带通滤波器进行检测。未凋亡的活细胞因JC-1聚集后线粒体呈红色，最大发射波长为590 nm。凋亡和坏死细胞染料一直以单体形式存在，线粒体呈现绿色。最大发射波长为530 nm。

B． 贴壁细胞

1）培养皿内用盖玻片进行细胞爬片或者细胞培养在腔室玻片（chamber slide）上。选择合适的化合物根据特定的步骤进行凋亡诱导。

2）染色前开始配制JC-1工作液，配制步骤见上。

3） 吸掉细胞培养液，然后加入足够覆盖所有细胞的JC-1工作液。于37℃，5%CO2培养箱孵育15-30 min；注意：一般情况，15 min足以进行充分的染色。

4）吸掉培养液，然后用合适的缓冲液来清洗细胞2次。

5）加入2 mL细胞培养液（培养液可含有血清和酚红）或者PBS缓冲液，于荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察。数据分析同A. 悬浮细胞。

4. JC-1染色步骤（荧光酶标仪）

1）-7）同上JC-1染色步骤（流式细胞仪）；

9）用300 μL缓冲液重悬细胞；然后按照每孔100 μL的量将染色好的细胞转移到黑色的96孔板内，即可进行荧光酶标板分析。注意：请马上进行荧光显微分析，此细节重要。

数据分析：健康细胞内，JC-1单体聚集形成聚合物，线粒体呈现强烈的红色荧光（激发波长550 nm, 发射波长600 nm）。凋亡或坏死细胞内JC-1以单体形式存在，线粒体呈强烈的绿色荧光（激发波长485 nm, 发射波长535 nm）。然后计算红色荧光信号与绿色荧光信号的比值，用来判断细胞健康程度。

注意事项

1）JC-1是光敏感性的，所有染色步骤的操作过程中避免强光接触。

2）JC-1染色完成后，立即进行后续的结果分析非常必要；

3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

4）本产品仅作科研用途！