HRbio™  Universal qPCR SYBR Green Master Mix

HRbio™  Universal qPCR SYBR Green Master Mix

价格:798

货号

产品详情

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产品信息

 

产品名称

产品编号

规格

HRbio™  Universal qPCR SYBR Green Master Mix

HRF0061

1 mL

HRF0062

5×1 mL

HRF0063

50×1 mL

 

产品描述

 

      HRbio™  Universal qPCR SYBR Green Master Mix是 2×实时定量 PCR 扩增的预混合溶液。Mix 中含有热启动 HRbio™  DNA Polymerase 、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+等。使用时,仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光 定量 PCR,大大简化操作过程,降低污染几率。

      本品采用的 DNA 聚合酶配体可以随温度变化实时调节 DNA 聚合酶活性。配方添加了有效抑制非特异性 PCR 扩增的因 子和提升 PCR 反应扩增效率的因子, 使定量 PCR 可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

 

适用机型

 

本产品可以适配市面上绝大部分主流荧光定量PCR仪。

 

运输和保存方法

 

冰袋运输。-20℃保存,有效期18个月。

本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料 SYBR Green I,保存或配制反应体系时需避免强光照射。

 

注意事项

 

1)解冻后Master Mix可能出现絮状物质, 4℃放置并上下颠倒混匀至溶液澄清,不影响试剂性能。

2)推荐使用本公司cDNA合成试剂盒(货号:HRF0182),以有效去除 RNA 样品中残留的基因组。

3)为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

4)本产品仅作科研用途!

 

反应体系

 

组分

体积(μL)

体积(μL)

终浓度

HRbio™  Universal qPCR SYBR Green Master Mix

25

10

Forward Primer (10 μM)

1

0.4

0.2 μM

Reverse Primer (10 μM)

1

0.4

0.2 μM

模板 DNA

X

X

-

无菌超纯水

To 50

To 20

-

【注】: 使用前务必充分混匀, 避免剧烈震荡产生过多气泡。

a)  引物浓度:通常引物终浓度为0.2 μM,也可以根据情况在 0.1- 1.0 μM 之间进行调整。

b)  模板浓度:如模板类型为未稀释 cDNA 原液,使用体积不应超过 qPCR 反应总体积的 1/10。

c)  模板稀释:cDNA 原液建议 5- 10 倍稀释,最佳模板加入量以扩增得到的 CT 值在 20-30 个循环为好。

d)  反应体系:推荐使用20 μL 或 50 μL ,以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

e)  体系配制:请于超净工作台内配制, 并使用无核酸酶残留的枪头、反应管; 推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

 

扩增程序 (两步法)

 

循环步骤

温度

时间     

循环数

预变性

95℃

5 min

1

变性

95℃

10 sec

40

退火/延伸

60℃

30 sec★

熔解曲线阶段

仪器默认设置          1

 

扩增程序 (三步法)

 

循环步骤

温度

时间     

循环数

预变性

95℃

5 min

1

变性

95℃

10 sec

40

退火

55-60℃

20 sec

延伸

72℃

20 sec★

熔解曲线阶段

仪器默认设置          1

【注】高特异性可选择两步法,高效率扩增可选择三步法。

a)  预变性时间: 根据不同模板和引物的具体情况可适当缩短至 2 min。

b)  退火温度和时间:请根据引物和目的基因的长度进行调整。

c)  荧光信号采集( ★):请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置,几种常见仪器的时间设定如下:

30sec 以上:

Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast;Roche Applied Science: LightCycler 480;Bio-Rad: CFX96

31sec 以上: Applied Biosystems: 7300

34sec 以上: Applied Biosystems: 7500

d)  熔解曲线: 通常情况下可以使用仪器默认程序。

 

结果分析

 

定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。

1)扩增曲线:

标准扩增曲线为 S 型。

Ct 值落在 20-30 之间时, 定量分析最准确;

Ct 值小于 10 ,需要将稀释模板后,重新进行实验;

Ct 值介于 30-35 之间时, 需要提高模板浓度,或者增大反应体系的体积,以提高扩增效率,保证结果分析的准确性;

Ct 值大于 35 时,检测结果无法定量分析基因的表达量,但可用于定性分析。

 

2)  熔解曲线:

熔解曲线单峰,表明反应特异性好可以进行定量结果分析;若熔解曲线出现双峰或者多峰,则不能进行定量分析。 熔解曲

线出现双峰,需要通过 DNA 琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。

如果是引物二聚体,建议降低引物浓度,或者重新设计扩增效率高的引物。

如果是非特异性扩增,请提高退火温度,或者重新设计更高特异性的引物。

 

引物设计指南

 

1.推荐引物长度25 bp 左右。扩增产物长度 150 bp 为佳,可以在 100 bp-300 bp 内选择。

2.正向引物和反向引物的 Tm 值相差不宜超过 2℃ 。引物 Tm 值 60℃-65℃为佳。

3.引物碱基分布要均匀, 避免出现连续的 4 个相同碱基, GC 含量控制在 50%左右。 3’端最后一个碱基最好为 G 或 C。

4.引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有 3 个碱基以上的互补序列。

5.引物特异性需要用 NCBI BLAST 程序进行核对。避免引物 3’端有 2 个碱基以上的非特异性互补。

6.设计完成的引物需要进行扩增效率的检测,只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

 

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