• 说明书HRK0612-硝酸还原酶（NR）试剂盒（NADH速率法）.pdf

产品信息

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

NR（ EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。

测定原理

NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO^3ˉ +NADH+H^＋→ NO2ˉ +NAD^＋ +H₂O；NADH在 340 nm 有最大吸收峰，通过测定NADH减少速率来表示NR活性。

需自备的仪器和用品

酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

诱导剂储备液：液体50mL×1瓶，4℃保存。

提取液：液体120mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体10mL×1瓶，-20℃保存。

试剂二：粉剂×2瓶，-20℃保存； 临用前每瓶加2ml  提取液溶解，现配现用。

诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL蒸馏水，充分混匀。

样本前处理

动植物组织样品的前处理:

（1）取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干。

（2）按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

注意：1、建议使用新鲜没有冷冻过的样本。

2、一般不要诱导处理，预测定结果没有活性（ΔA≤0）则需要诱导处理。

细菌或培养细胞的前处理

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm。

2、样本测定

在 96 孔板中依次加入 10μL 样本上清，75μL 试剂一，90μL 蒸馏水，最后加入 25μL 试剂二。充分混匀后，记录 1min 时吸光值 A1 和 6min 时吸光值 A2，ΔA=A1-A2。

NR活性计算

（1）按样本鲜重计算：

单位定义：每min每g鲜重样品中催化减少 1nmol NADH的量为一个 NR活力单位。

NR（nmol/min/g 鲜重）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=1286×ΔA÷W

（2）按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每min每mg组织蛋白催化减少 1μmol NADH的量为一个 NR活力单位。

NR（nmol/min/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

V 反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96
孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：
反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g

注意事项

本产品仅作科研用途！