• Minute™ 内体和细胞组分分离试剂盒 ED-028_CN.pdf

产品信息

产品描述

      初级内体（EE）是次级成熟内体的起点，初级内体主要是由内吞的囊泡相互融合形成。初级内体不仅仅通过网格蛋白介导的信号通路接受胞吞物，还有其他许多通路。胞吞机制除了在维持正常细胞生理中起到重要作用，还在阿尔兹海默病和遗传性溶酶体储积症等许多疾病中发挥了很大作用。

应用

      本试剂盒可以从培养的细胞和组织样品中大量沉淀富集初级内体，用于SDS-PAGE、immunoblottings、ELISA、IP、MS、2-D、酶活性检测等其他应用。

使用说明

1. 将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。

2. 培养的细胞样品。低速离心（500-600xg，5 分钟）收集 10-30 x106细胞，接第 3a 步。组织样品接第 3b 步。

3a. 用预冷的 PBS 清洗细胞，完全去除上清，加 500ul 缓冲液 A 将细胞重悬，并放置于冰上孵育5-10 分钟，大力涡旋振荡 10-30 秒，立即将细胞悬液转移至离心管柱中，接第 4 步。

3b. 组织样品。将 10-20mg 组织样品（新鲜或冷冻）放置于离心管柱上，加 200ul 缓冲液 A，用塑料棒反复挤压扭转研磨 1 分钟。（注：如果样品是骨骼肌和心肌，建议在研磨时添加 80-100mg组织分离粉到离心管柱上）再加入 300ul 缓冲液 A 到离心柱里，用移液器上下吹打几次，开盖冰上孵育 5 分钟，接第 4 步。

注意：一些未均质组织的存在不会影响样品的质量。塑料棒可以重复使用，用 70%的酒精清洗即可。

4. 盖上盖子，16000xg 离心 30 秒（建议使用可在 10s 内升至 16000Xg 的台式离心机）。离心后可将收集管中的样品重悬，再过一次柱子以增加最终内体的产量。

5. 弃去离心管柱，将收集管的液体涡旋振荡混匀 10 秒，700xg 离心 2-3 分钟（沉淀为完整的细胞核和一些未破裂的细胞）

6. 将上清转移至一个新的 1.5ml 离心管中，16000xg，4oC 离心 30-60 分钟（延长离心时间可以提高纯度）。离心后，再次将上清转移至一个新的 1.5ml 离心管中（沉淀为大的细胞器和质膜）。

7. 估算管中溶液体积，加入一半体积的缓冲液 B,振荡混匀（样品与缓冲液 B 的比例为 2：1，也可以根据最终内体得率按照 0.25：1 或者 1：1 减少或增加缓冲液 B 的量）4oC 孵育 1h 或过夜（延长时间可以增加产量）。

8. 10000xg，4oC 离心 30 分钟，弃掉上清（上清是胞浆组分，可选择保留），沉淀即是内体。产量通常在 20-100ug 每个样品。内体可以根据下游实验选择任何溶解液重悬溶解。

储存条件

4℃下储存。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）本产品仅作科研用途！