• HRK0589-类黄酮糖基转移酶试剂盒说明书-HPLC.pdf

产品信息

正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

类黄酮是植物次生代谢产物，糖基化是类黄酮基本结构形成的最主要的修饰反应之一，提高了类黄酮苷元的化学稳定性，这一过程主要由类黄酮糖基转移酶催化的，使类黄酮-OH与UDPG反应，是黄酮合成途径中的关键酶。

测定原理

类黄酮糖基转移酶催化花青素与尿苷二磷酸葡萄糖反应产生花青苷，主要以矢车菊素3-葡萄糖苷（C3G）形式存在，用HPLC检测产物可反映类黄酮糖基转移酶的酶活性。

自备实验用品及仪器

天平、研砵、离心机、恒温水浴锅、100目筛、高校液相色谱、针头过滤器（水系、0.22μm）、滤膜（水系、0.45μm）、耐水C18柱（4.6×250mm）、样品瓶、甲酸、甲醇（色谱级）、超纯水

试剂组成和配制

提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加全部试剂三溶解。

试剂二：液体5mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体8mL×1瓶，4℃保存。

标准品：标准品×1支，-20℃保存。

样本处理

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：2~5的比例（建议称取约0.5g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g ，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

实验前的准备工作

1、检测产物制备

2、将500 mL超纯水和500 mL甲醇用0.45 μm的滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱。（注：蒸馏水用水系滤膜抽滤，甲醇用有机系滤膜抽滤）。

3、流动相的配制：流动相A为1.6%甲酸水溶液； 流动相B为1.6%甲酸甲醇溶液。

4、将配好的流动相超声30分钟，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱。

5、标准品的配制：

在标准品中加入1mL甲醇，配成5μmol /mL 母液，将母液用甲醇分别稀释成2μmol/mL ，1μmol/mL 、0.5μmol/mL 、0.25μmol/mL、0.125μmol/mL的标准品溶液。针头式过滤器过滤后待测。

测定操作步骤

1.开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量10 μL，梯度洗脱为0~5min，85%A+15%B; 5~10min，85%A+15%B; 10~30min，80%A+20%B; 30~30.1min， 60%A+40%B; 30.1~40min，0%A+100%B。流速1mL/min，柱温30℃，走样时间为50min，检测波长530nm，设置完毕保存方法组。

2.初始设置流动相A=85%，流动相B=15%，流速1 mL/min，待基线稳定后开始加样。

3.加入标准品10 μL，在50min内可分离C3G，C3G的保留时间在25min左右，（柱子不同，保留时间有差异），计算不同浓度的C3G标准品的峰面积。

4. 加入样品10 μL，在相应保留时间处检测C3G的峰面积。

酶活计算

1.以标准品浓度（μmol/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标计算C3G标准曲线。将样品峰面积代入标准曲线，计算样品C3G含量。

2.酶活单位定义：

-每毫克组织蛋白每分钟催化反应产生1μmolC3G定义为一个酶活单位。

UFGT活性（μmol/min/mg prot）= C×V反总÷（V样×Cpr）÷ T=0.117×C÷Cpr

-每克组织每分钟催化反应产生1μmolC3G定义为一个酶活单位。

UFGT活性（μmol/min/g 鲜重）= C×V反总÷（V样×W÷V样总）÷ T=0.117×C÷W

C：C3G浓度，μmol/mL ；V反总：反应总体积，0.35mL；V样：加入样本量，0.1mL，V样总：加入提取液体积，1mL，Cpr：蛋白含量，mg/mL；W：样本质量，g，T：反应时间，min

注意事项

1.流速由小到大调节，避免柱压过大。

2.使用完毕时，先用50%的甲醇水溶液洗色谱柱45min，再用纯甲醇冲洗色谱柱30min。

3.标准品的稀释倍数要根据样品中C3G浓度确定，样品中C3G的峰面积必须落在不同浓度的C3G标准品的峰面积之内，该标准品稀释倍数只是一个参考。

4.本产品仅作科研用途！