• Minute™ 质膜脂筏分离试剂盒 LR-042_CN.pdf

产品信息

产品描述

      脂筏是含有高水平胆固醇和鞘脂的小质膜结构域。脂筏被发现存在于质膜（PM）和一些内膜系统中，如线粒体相关膜（MAMS）和内质网等。脂筏参与许多细胞过程，如信号转导，膜转运和蛋白质分选。脂质修饰的蛋白质和一些跨膜蛋白质集中在脂筏中，而其他蛋白质被排除在外。脂筏还被发现与质膜上的Na+ / K+ ATP酶相关。传统的脂筏分离方法是从总膜结构中分离出脂筏，而不能分质膜或者细胞器膜上的脂筏。为了克服传统方法的缺点，我们开发了此款基于离心管柱技术的质膜脂筏分离试剂盒。首先较大的质膜囊泡被分离出来，然后使用含有非离子表面活性剂缓冲液处理，通过台式离心机即可离心分离质膜脂筏部分。不使用传统的匀浆机和超速离心机，1h左右即可高度富集质膜脂筏。

应用

      提取的蛋白可用于SDS-PAGE ，ELISA ，IP，2D胶分析，质谱，酶活检测以及其他应用。

使用说明

.将离心管柱放入收集管中并在冰上孵育。使用前在冰上预冷冻缓冲液 A 和 B，不要预冷缓冲液 C！

2. A.培养的细胞样品，通过低速离心（500-600×g，5 分钟）收集 30-40×10 6 个细胞。用预冷 PBS 洗涤细胞一次。完全除去上清液，将沉淀重悬于 500μl 缓冲液 A 中。将细胞悬浮液在冰上孵育 5 分钟。剧烈涡旋 10-30 秒。立即将细胞悬浮液转移到离心管柱中。转到第 3 步。

B. 柔软的组织样本，将 40-50 mg 组织（新鲜或冷冻）放入离心管柱中。将 200μl 缓冲液 A 加入离心管柱中，用塑料棒向下扭转反复研磨组织 2-3 分钟。研磨后，将 300μl 缓冲液 A 加入同一离心管柱中。转到步骤 3。肌肉组织样品，将组织放在干净的玻璃或塑料板的表面上，用锋利的刀片将组织切成组织匀浆状。将组织转移到离心管柱中，并如上所述进行研磨。塑料棒是可重复使用的，用 70％酒精或水清洗。

3.盖上离心管柱，倒置混匀几次，然后 16,000Xg 离心 30 秒。（可选优化：细胞样品过柱之后，可以再次重悬细胞，转移回同个离心管柱中再次过柱，可以增加产量）

4.丢弃离心管柱，大力涡旋震荡 10 秒钟重悬沉淀。1900Xg 离心 5 分钟（沉淀物包含细胞核，大细胞碎片和一些未破裂的细胞）。

5.将所有上清液转移到新鲜的 1.5ml 离心管中，3000Xg，4 度，离心 15 分钟，小心地将所有上清弃掉。沉淀是分离出的质膜组分（质膜囊泡）。

6. 用 400μl 预冷缓冲液 B 移液器吹打 20-30 次将沉淀重悬，在冰上孵育 30 分钟，每 10 分钟短暂涡旋一次，立即将管子放回冰上，使其始终保持冷却。

7.加 400μl 缓冲液 C 到离心管中，涡旋混匀（处理会使得溶液变浑浊）。将离心管 10,000Xg 离心 5 分钟，离心后，脂筏漂浮在管的顶部。

8. 用移液器配上细的吸头（如 SDS-PAGE 上样吸头）插到管底，缓慢地完全去除水相。或者也可以使用 21 号 2针头的 2 毫升注射器。去除水相后，灰白色的脂筏会附着在离心管壁上。

9.将离心管，16000Xg 离心 2min，使脂筏离心到管底部，完全去除残留液。这个沉淀即是分离的质膜脂筏，沉淀可使用 100-300μl 以下推荐的溶解液重悬用于实验，也可根据下游应用选择适合的其他溶解液。根据细胞/组织类型不同，最终蛋白质产量在 30-200 μg/样品范围内。

储存条件

4℃下储存。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）本产品仅作科研用途！