• 说明书丨HRQ0272-动物组织 细胞RNA快速提取试剂盒.pdf

产品信息 

产品描述

       本试剂盒采用了特殊的离心吸附柱和缓冲液体系，可以从动物组织/细胞中快速提取总RNA。只要25min左右即可完成提取，操作简单，使用方便。提取出的总RNA不含有蛋白和其他杂质，纯度极高，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、Poly A筛选、体外翻译和分子克隆等多种下游实验。

      本动物组织/细胞RNA快速提取试剂盒通用型强，兼容性好，可广泛使用于各类组织/细胞样本的提取。目前已验证可用于提取NIH/3T3细胞、HeLa细胞、COS-7细胞、LMH细胞、Huh细胞、鼠或大鼠的胚胎、肾、肝、脾、肺、胸腺等各类细胞或组织样本。

产品组分

产品特点

1.不使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

2.简捷，单个样品操作一般可在25分钟内完成。

3.适应性比较广泛，可以提取包括NIH/3T3细胞、HeLa细胞、COS-7细胞、LMH细胞、Huh细胞、鼠或大鼠的胚胎、肾、肝、脾、肺、胸腺等各类细胞或组织样本。

4.多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀ 典型的比值高达 2.1～2.2，基本无 DNA 残留，可用于RT-PCR，Northern-blot 和各种实验。

运输和保存方法

1.本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。

2.试剂盒储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。

3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH 值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

典型的细胞/组织RNA产量

不同细胞或组织中RNA含量

注意事项

1、实验过程使用的离心机均可在室温进行（4℃也可以），转速可以达到12,000rpm的传统台式离心机

2、需要自备乙醇、β-巯基乙醇或者DTT和研钵。

3、样品处理量不能超过离心柱的处理能力，否则容易导致DNA残留或者RNA产量降低

4、RLT和RW1中含有刺激性化合物，操作时务必戴手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

5、样品处理量不要超过吸附柱处理能力，否则造成 DNA 残留或者产量降低。不同组织细胞种类 RNA/DNA 相差较大，例如胸腺脾脏 DNA 含量丰富，超过 5mg就会超过柱子处理能力。COS 细胞 RNA 含量丰富，超过 3x10⁶ 细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品 DNA/RNA 含量时宁可使用较少的样品处理量，如细胞不超过 3-4×10⁶，组织不超过10mg。后续根据样品试验情况增加或者减少处理量。

6、关于DNA的微量残留：

一般说来任何总 RNA 提取试剂在提取过程中无法完全避免 DNA 的微量残留（DNase 消化也无法做到 100%无残留），本公司的 RNA 提取产品，由于采取了本公司特殊的裂解液体系和离心管吸附柱技术，绝大多数 DNA 已经被清除，不需要 DNase 消化，可直接用于RT- PCR 和qPCR。个别特殊情况如 DNA 含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA 表达量分析荧光定量 PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：

（1）选用跨内含子的引物，以穿过 mRNA 中的连接区，这样 DNA 就不能作为模参与扩增反应。

（2）选择基因组 DNA 和 cDNA 上扩增的产物大小不一样的引物对。

（3）在步骤去蛋白液 RW1 漂洗前，直接在离心柱上进行 DNase I 柱上消化处理。购买 DNA 酶柱上消化试剂盒(货号：HRN0291)前可先索取具体操作说明书。

7、RNA纯度及浓度检测：

完整性：RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度 1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5 kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。

纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的RNA，OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的 OD260/OD280 读数1.8-2.1之间，

在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。

浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计

调零，取稀释液进行OD260, OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μL）= (OD260)×(稀释倍数n)×40。

8、本产品仅作科研用途！

使用方法

提示：

→第一次使用前请先在 Buffer RPE，Buffer RW1中添加指定量的无水乙醇，并做好标记！

→在使用前加入10μL β-巯基乙醇或20μL的2M DTT到1mL Buffer RLT中，含有β-巯基乙醇或者DTT的裂解液可在室温下保存长达1个月。

（一）、组织培养细胞

1、收集＜10⁷悬浮细胞到一个1.5mL离心管，对于贴壁细胞，孔板培养可以直接裂解，细胞培养瓶培养的，应该先用胰酶消化后吹打下来收集。

2、12,000rpm离心10秒，使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量和纯度降低。

3、轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬，加入350μL（＜5×10⁶细胞 ）或600μL（5×10⁶-1×10⁷细胞）裂解液 Buffer RLT，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒充分裂解。

4、匀浆：（处理细胞量极少时＜1×10⁵一般不需要，涡旋振荡1min匀浆）。用钝针头的一次性1 mL(配 0.9mm 针头) 注射器剧烈抽打裂解物10次以上或直到得到满意的匀浆结果（或者电动匀浆30秒），可以剪切DNA，降低粘稠度防堵塞柱子和提高含量。

5、将裂解混合物或匀浆混合物全部加到gDNA清除柱上（清除柱放在收集管内）。

6、立刻 12,000 rpm离心60秒，保留滤过液（RNA在滤过液中）。

7、用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为 350μL/600μL，滤过时候损失体积应该减去），加入等体积的70%乙醇，此时可能出现沉淀，但不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。立刻将混合物（每次小于700μL，多可以分两次加入）加入到RNA吸附柱中，吸附柱放入收集管中，立刻12,000rpm离心30秒，弃掉废液。

8、加入700μL Buffer RW1，室温放置1min，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。

9、加入500μL Buffer RPE（使用前请检查是否已经加入无水乙醇），12,000rpm离心30秒，弃掉废液，再次加入500μL Buffer RPE，重复一遍。

10、将RNA吸附柱放回空收集管中，12,000 rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

11、去除RNA吸附柱，放入全新的无酶离心管中，在吸附膜的中间部位加入30-50μL无酶水，室温放置1min，12,000rpm离心1min，离心管中获得的液体就是RNA。

如果预期RNA产量>30μg，加30-50μL 无酶水重复步骤 12，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。

洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15-30%，但是浓度要低。

（二）、动物组织（例如鼠肝脑）

1、电动匀浆：新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块，加入350μL(<20mg 组织)或者 600μL(20-30mg组织)的裂解液 Bufffer RLT 后电动彻底匀浆20-40秒。

2、液氮研磨和匀浆：组织在液氮中研磨成粉，取适量组织细粉(20mg/30mg)转入装有 350μL/600μL 组织裂解液 Bufffer RLT 的 1.5mL 离心管中，用手剧烈振荡20秒，充分裂解。用带钝针头的一次性1mL(配 0.9mm 针头) 注射器剧烈抽打裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电

动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度防堵塞柱子和提高产量。

3、将匀浆后裂解物12,000rpm 离心 3 min，沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物，将裂解物上清全部加到DNA吸附柱上（吸附柱放在收集管内组装好）。

4、立刻 12,000 rpm 离心 60 秒，保留滤过液（RNA 在滤过液中）。

5、用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为 350μL/600μL，滤过时候损失体积应该减去），加入等体积的 70%乙醇，此时可能出现沉淀，但不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心立刻将混合物（每次小于 700μL，多可以分两次加入）加入到 RNA 吸附柱中，吸附柱放入收集管中，立刻 12,000rpm 离心 30 秒，弃掉废液。

6、加入 700μL Buffer RW1，室温放置 1min，12,000rpm 离心 30 秒，弃掉废液。

7、加入 500μL Buffer RPE（使用前请检查是否已经加入无水乙醇），12,000rpm 离心 30 秒，弃掉废液，再次加入 500μL Buffer RPE，重复一遍。

8、将 RNA 吸附柱放回空收集管中，12,000 rpm 离心 2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

9、去除 RNA 吸附柱，放入全新的无酶离心管中，在吸附膜的中间部位加入 30-50μL 无酶水，室温放置 1min，12,000rpm 离心 1min，离心管中获得的液体就是 RNA。

如果预期 RNA 产量>30μg，加 30-50μL 无酶水重复步骤 12，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要 RNA 浓度高)。

洗脱两遍的 RNA 洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的 RNA 产量比前者高 15-30%，但是浓度要低。

附表1：贴壁培养细胞数量表