• 说明书丨HRQ0171-酵母RNA快速提取试剂盒.pdf

产品信息 

产品描述

本试剂盒采用了特殊的离心吸附柱和缓冲液体系，可以从酵母中提取总RNA。酵母细胞经溶壁酶处理，去除细胞壁后，独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，然后用乙醇调节结合条件后，RNA选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过快速的漂洗-离心等步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物和蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase free H₂0将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

产品组分

产品特点

1.不使用有毒的苯酚，氯仿等试剂等步骤。

2.简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。

3.多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀ 典型的比值高达 2.1～2.2，基本无 DNA 残留，

可用于RT-PCR，Northern-blot 和各种实验。

运输和保存方法

1、本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。

2、试剂盒储存于低温（4℃或者-20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃-25℃）进行。

3、避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH 值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

注意事项

1、实验过程使用的离心机均可在室温进行（4℃也可以），转速可以达到12,000rpm的传统台式离心机

2、需要自备乙醇、β-巯基乙醇。

3、样品处理量不能超过离心柱的处理能力，否则容易导致DNA残留或者RNA产量降低

4、RLT和RW1中含有刺激性化合物，操作时务必戴手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

5、关于DNA的微量残留：

一般说来任何总 RNA 提取试剂在提取过程中无法完全避免 DNA 的微量残留（DNase 消化也无法做到 100%无残留），本公司的 RNA 提取产品，由于采取了本公司特殊的裂解液体系和离心管吸附柱技术，绝大多数 DNA 已经被清除，不需要 DNase 消化，可直接用于RT- PCR 和qPCR。个别特殊情况如 DNA 含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA 表达量分析荧光定量 PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：

（1）选用跨内含子的引物，以穿过 mRNA 中的连接区，这样 DNA 就不能作为模参与扩增反应。

（2）选择基因组 DNA 和 cDNA 上扩增的产物大小不一样的引物对。

（3）在步骤去蛋白液 RW1 漂洗前，直接在离心柱上进行 DNase I 柱上消化处理。购买 DNA 酶柱上消化试剂盒(货号：HRN0291)前可先索取具体操作说明书。

6、本产品仅作科研用途！

使用方法

提示：

→第一次使用前请先在 Buffer RW1，Buffer RPE中添加指定量的无水乙醇，并做好标记！

→在使用前加入10μL β-巯基乙醇或20μL的2M DTT到1mL Buffer RLT中，含有β-巯基乙醇或者DTT的裂解液可在室温下保存长达1个月。

→吸取使用量（正常小量酵母使用100μL，中量酵母使用600μL）的缓冲液Buffer Y1，向缓冲液中添加0.1%的β-巯基乙醇。

一、小量酵母培养细胞

1、收集1mL（约10⁷细胞）处于对数生长期酵母培养物到1.5mL离心管，12,000rpm离心30秒，尽可能吸弃上清。

2、加入100μL Buffer Y1，（请确保已经加入了0.1%的β-巯基乙醇），轻柔吹打充分重悬细胞；根据酵母量加入约50U溶壁酶，充分颠倒混匀，37℃孵育15-30分钟以消化细胞壁，中间可颠倒数次促进消化。

注意：如果破壁效果不好导致RNA产量低，可以加大溶壁酶的用量来提高酶的工作浓度，还可以延长消化时间提高效果，不适合用溶壁酶消化的酵母可以用玻璃珠涡旋或者反复冻融等方法破壁。

3、加入350μL Buffer RLT，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。

4、组装好gDNA清除柱和收集管，将步骤3的溶液添加到gDNA清除柱中，12,000rpm离心2min。小心将收集管中的上清转移到新的离心管中（不要碰到收集管中的沉淀物）。

5、加入250μL 无水乙醇，立即吹打混匀。

6、将上述混合物加入到一个新的RNA吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm离心60秒，弃废液，收集管重复使用。

7、加入700μL的 Buffer RW1到离心柱中，盖好盖子，12,000rpm离心15秒，弃废液，收集管重复使用。

8、加入500μL Buffer RPE到离心柱中，盖好盖子，12,000rpm离心15秒，弃废液，收集管重复使用。

9、重复一遍，加入500μL Buffer RPE到离心柱中，盖好盖子，12,000rpm离心2min（较长时间的离心，确保RNA洗脱过程中没有乙醇残留）

*10、该步骤为可选择步骤，将离心柱装填到全新的1.5mL离心管中，盖好盖子，12,000rpm离心1min，可完全去除残留的Buffer RPE。

11、将RNA吸附柱放置到全新的1.5mL离心管中，向吸附柱的膜中央加入30-50μL的无酶水，盖好盖子，12,000rpm离心1min，洗脱收集RNA。

说明：如果预期RNA产量＞30μg，另外再加入30-50μL的无酶水到离心柱中，重复步骤12，合并两次洗脱液；如果需要高浓度的RNA，建议将第一次的洗脱液加回到离心柱上，重复步骤12。

洗脱两遍RNA的洗脱液的RNA浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15-30%，但是浓度要低，使用者根据需要进行选择。

二、中量酵母培养细胞

1、收集2-3mL（约3×10⁷细胞）处于对数生长期酵母培养物到1.5mL离心管（可以分两个离心管收集），12,000rpm离心30秒，尽可能吸弃上清。

2、取600μL Buffer Y1（请确保已经加入了0.1%的β-巯基乙醇），轻柔吹打、充分重悬步骤1中获得的酵母，根据酵母量加入约100-150U的溶壁酶，充分颠倒混匀，37℃孵育15-30分钟消化细胞壁，中间颠倒数次帮助消化。

注意：如果破壁效果不好导致RNA产量低，可以加大溶壁酶的用量来提高酶的工作浓度，还可以延长消化时间提高效果，不适合用溶壁酶消化的酵母可以用玻璃珠涡旋或者反复冻融等方法破壁。

3、12,000rpm离心1分钟，尽可能吸弃上清。

4、加入350μL Buffer RLT，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。

5、组装好gDNA清除柱和收集管，将步骤4的溶液添加到gDNA清除柱中，12,000rpm离心2min。小心将收集管中的上清转移到新的离心管中（不要碰到收集管中的沉淀物）。

5、加入350μL 70%乙醇（用DEPC水配制），立即吹打混匀。

6、将上述混合物加入到一个新的RNA吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm离心60秒，弃废液，收集管重复使用。

7、加入700μL的 Buffer RW1到离心柱中，盖好盖子，12,000rpm离心15秒，弃废液，收集管重复使用。

8、加入500μL Buffer RPE到离心柱中，盖好盖子，12,000rpm离心15秒，弃废液，收集管重复使用。

9、重复一遍，加入500μL Buffer RPE到离心柱中，盖好盖子，12,000rpm离心2min（较长时间的离心，确保RNA洗脱过程中没有乙醇残留）

*10、该步骤为可选择步骤，将离心柱装填到全新的1.5mL离心管中，盖好盖子，12,000rpm离心1min，可完全去除残留的Buffer RPE。

11、将RNA吸附柱放置到全新的1.5mL离心管中，向吸附柱的膜中央加入30-50μL的无酶水，盖好盖子，12,000rpm离心1min，洗脱收集RNA。

说明：如果预期RNA产量＞30μg，另外再加入30-50μL的无酶水到离心柱中，重复步骤12，合并两次洗脱液；如果需要高浓度的RNA，建议将第一次的洗脱液加回到离心柱上，重复步骤12。

洗脱两遍RNA的洗脱液的RNA浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15-30%，但是浓度要低，使用者根据需要进行选择。