• 说明书丨HRX1204-TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（TRITC 红色荧光标记法）.pdf

产品信息 

产品描述

    细胞在发生凋亡时，一些核酸内切酶会被激活，开始切断核小体间的基因组 DNA，DNA被切断后会产生缺口，并暴露出 3’-OH 末端，在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的催化下可以连接经过标记的 dUTP。因为正常的细胞几乎没有 DNA 的断裂，所以针对 dUTP 进行检测即可判断待测细胞的凋亡状态，这种方法也被称为 TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）法检测细胞凋亡。

    本产品是用生物素（Biotin）标记 dUTP，并可与连接红色荧光素（Tetramethylrhodamine，TRITC）的链霉亲和素（Streptavidin-TRITC）特异结合，通过这种生物素-链霉亲和素放大系统，使 TRITC 标记的链霉亲和素与生物素结合，从而可以在荧光显微镜下观察并计数凋亡细胞。

    本产品适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片或爬片）的凋亡原位检测。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜检测到凋亡细胞。

产品组成

运输和保存

20℃保存，Streptavidin-TRITC、标记缓冲液4℃C保存，有效期一年。

使用方法

一、样品处理：

（a）细胞涂片或冷冻切片

1、将自然晾干的细胞样本（细胞涂片或爬片）或冷冻切片浸入盛有 4%多聚甲醛固定液的染色缸，室温（15-25℃）固定 20-30min。

2、样本片浸入 1×PBS 漂洗三次，每次 5min。

3、配制 1%Triton X-100 通透液（例如往 99ml 的 1×PBS 溶液中加入 1 ml Triton X-100）， 混匀，即用即配。 

4、样本片浸入通透液中，室温 3-5min；之后浸入 1×PBS 漂洗三次，每次 5min。

（b）石蜡切片 

1.切片按常规方法进行脱蜡，60℃烘干 60min 后，二甲苯脱蜡 2 次，乙醇水合（100%， 95%，80%，75%）每次 5min。

2.然后浸入 1×PBS 漂洗三次，每次 5min。 

3.配制蛋白酶 K 工作液：计算好样本数量集中配制，每样本 90ul 1×PBS 加入 10ul 10 ×蛋白酶 K，即用即配。 

4.每个组织切片上滴加 100ul 蛋白酶 K 工作液，37℃反应 30min。切片浸入 1×PBS 漂 洗三次，每次 5min（注意：对于部分固定过久的样本可选用微波方法：将切片置于 pH6.0 柠 檬酸盐缓冲液中，微波中高火 8min 后，取出降温）。 

二、制备阳性对照： 

1、根据样本类型不同，配置 100ul 含不同活性单位（U）的 DNase I 反应液，配方如下：

2、在一张样本上滴加 100ul 配制好的 DNase I 反应液，在 37℃处理 30min。

3、上述制备好的阳性对照浸入 1×PBS 漂洗三次，每次 5min。

注：阳性对照只针对实验体系进行设置对照，不需要每片制备。

三．连接：

1、配制 TdT 酶反应液：计算好样本数量集中配制（不计算阴性对照）：每个样本需要 45ul

平衡液+ 1ul Biotin-dUTP + 4ul TdT 酶，即用即配，注意避光操作。

2、样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加 50ul TdT 酶反应液，放入温盒中，37℃避光

反应 60min（注：阴性对照样本不加 TdT 酶反应液）。

3、反应后的样本片浸入 1×PBS 漂洗三次，每次 5min。

四．标记：

1、配制 Streptavidin-TRITC 工作液，计算好样本数量集中配制：每个样本需要 45ul 标记。

注意事项

1、实验前可将各个样本用免疫组化笔进行标记，另外需要准备2张样本切片分别用于阳性对照和阴性对照制备并做好对应标记。

2、各个工作液最好根椐计算好的样本数量集中配制，再分别滴加于各样本上，避免因每个样本单独配制而产生的试剂损耗，TdT酶反应液如需短暂保存时，请置于冰上。

3、对Streptavidin-TRITC操作时需要注意避光。

4、本产品仅限于专业人员科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。