• 说明书丨HRF0191-HRbio™+Ⅲ+1st+Strand+cDNA+Synthesis+Kit(OneStep+gDNA+Removal)一步法基因组DNA去除逆转录试剂盒.pdf

产品信息

产品描述

      本制品以RNA为模板，采用预混合技术，用5×HRbio™ III RT Reaction Mix（已经预混合了HRbio™ III Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor、dNTP Mixture、Buffer）高效合成第一链cDNA，操作简单。

      本制品采用分子进化技术，高达60°C的全新高温反转录酶，可以通读GC含量丰富，二级结构复杂的RNA模板，极大提高反转录效率和长度。 可用于更长的cDNA合成以及高比例的全长cDNA文库的构建等。本试剂盒中使用了具有DNA分解活性的特殊gDNA Remover，只需一步操作，即可同时完成基因组清除与逆转录反应，极大简化了操作步骤，避免了复杂加样过程造成的样品污染与RNA降解的风险。

产品用途

第一链cDNA合成。可用于高拷贝、低拷贝基因的克隆和检测，尤其适合GC含量高，复杂模板的高温反转录。

产品特点

1.新一代高温反转录酶极大提高了包括复杂RNA模板的反转录效率和长度。合成cDNA长度高达15 kb以上。

2.全预混的反转录Mix，只需加入RNA、引物和水，简单快速完成反转录。

3.RNA模板的体积最多可加到总体积的75%，非常适合于低浓度RNA模板的逆转录反应。

4.预混合Mix在-20°C不冻结，减少了化冻和混匀时间，使用更简单。用户可根据需要，可灵活选择Oligo (dT)、Random primer或基因特异引物作为逆转录引物。

产品组分

运输和保存方法

干冰运输。-20℃保存，避免反复冻融，有效期1年。

注意事项

1）避免RNase污染。

2）为保证反转录成功建议使用高质量的RNA样品。

3）可选步骤（一般不需要）：如果RNA模板GC含量丰富或者有复杂二级结构、或者扩增cDNA长度超过3kb，可以先只加RNA模板、引物和和RNase free H2O混匀，65°C变性5分钟，冰上冷却，短暂离心后加入其它成分继续下面的反转录步骤。

4）5×HRbio™ III RT Reaction Mix和gDNA Remover含甘油很粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用前请点甩离心后使用，并且避免吸头外壁沾附损失。5×HRbio™ III RT Reaction Mix内包含的酶均为过量，即使每次按照3.6 μl-3.8 μl使用，gDNA Remover按照0.8 μl-0.9 μl也不影响使用效果。

使用方法

引物选择：

1.如果模板为真核生物来源，一般情况下首选Oligo (dT)，与真核生物mRNA的3’ Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。

2.如果对一些物种，不能确定mRNA是否有polyA尾的情况下，首选Oligo (dT)，不成功再尝试基因特异性引物(GSP)和Random primer为引物。

3.gDNA Remover采用先进的一步基因组清除技术，最短时间最简单完成去除基因组DNA步骤。

4.基因特异性引物(GSP)的特异性最高。但有些情况下，用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成，可改用Oligo (dT)或Random primer重新进行逆转录。。

5.Random primer特异性最低，所有RNA，包括mRNA，rRNA，tRNA均可以作为Random primer的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源，使用Oligo (dT)或基因特异性引物(GSP)无法有效引导cDNA合成时，可使用Random primer为引物。

6.如果合成cDNA下游用于荧光定量PCR，可将Oligo (dT)与Random primer混合使用（各加1μl/20μl反应体系），可使mRNA的各个区域cDNA合成效率相同，有助于提高定量结果的真实性和重复性。

第一链cDNA合成(以20 μl反应体系为例)

1.加入以下成分（使用前将每种溶液轻弹或者轻微涡旋振荡混匀，可简短离心收集液体到管底。）

*如果反转录时不需要去除基因组DNA，直接略去gDNA Remover成分不加即可。

2.轻轻混匀

如用Oligo(dT)或基因特异引物(GSP)，50°C孵育30-50 min（如产物用于qPCR，50°C孵育15 min）；如用Random Primer，25°C孵育10 min，50°C孵育30-50 min（如产物用于qPCR，50°C孵育15 min）

注意：本制品在42°C-60°C反转录均有稳定良好效果。如果模板具有复杂二级结构或高GC区域，可尝试将反应温度提高至55°C-60°C，有助于提高产量。

3.85°C加热5 sec失活HRbio™ III Reverse Transcriptase。

4.得到的cDNA产物可立即用于PCR反应，或在-20°C保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-70°C保存。cDNA应避免反复冻融。

RT-PCR

建议取1/10-1/5 体积(2-4 μl)的反转录产物作为PCR模板。丰度高的可以酌情适当稀释cDNA后使用。

注意事项：

1. 避免RNase污染。
   2. 为保证反转录成功建议使用高质量的RNA样品。
   3. 可选步骤（一般不需要）：如果RNA模板GC含量丰富或者有复杂二级结构、或者扩增cDNA长度超过3kb，
   可以先只加RNA模板、引物和和RNase free H₂O混匀，65°C变性5分钟，冰上冷却，短暂离心后加入其
   它成分继续下面的反转录步骤。
   4. 5×HRbio™ III RT Reaction Mix和gDNA Remover含甘油很粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用
   前请点甩离心后使用，并且避免吸头外壁沾附损失。5×HRbio™ III RT Reaction Mix内包含的酶均为过量，
   即使每次按照3.6 μl-3.8 μl使用，gDNA Remover按照0.8 μl-0.9 μl也不影响使用效果。

2. 本产品仅作科研用途！