• 说明书丨HRN0496-细菌RNA快速提取试剂盒.pdf

产品信息

产品描述

      独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，然后用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

产品组分

本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。

储存事项:

1.所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。

2.不合适的储存于低温（4℃或者-20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃-25℃）进行。

3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品特点

1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

2.不需要使用有毒的苯酚,氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

3.快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。

4.多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留,可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

运输和保存方法

1）本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

2）避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

注意事项

1.所第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

2.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13，000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

3.需要自备乙醇。

4.裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有盐酸胍/异硫氰酸胍化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

5.预防RNase 污染，应注意以下几方面：

1)经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。

2)使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。

3)RNA在裂解液RLT中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。

4)配制溶液应使用无RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%( v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）

6.关于DNA 的微量残留：

一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留，本公司的RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大， 如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：

1)选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。

2)选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。

3)将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理以提高效果。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup)。

4)在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。

7.RNA 纯度及浓度检测：

完整性：RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于细菌中70%-80%的RNA 为rRNA，电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。 细菌rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb，分别相当于26S 和13S rRNA。细菌RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。

纯度： OD₂₆₀/OD₂₈₀比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的RNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀读数（10mMTris, pH7.5）在2.1-2.2 之间（100%纯的RNA比值一般是2.2左右，很多公司无法达到这个标准，所以1.9-2.0就凑合用了，但是我们的产品标准一般可以达到2.1-2.2）。OD₂₆₀/OD₂₈₀ 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD₂₆₀/OD₂₈₀读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。

浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD₂₆₀, OD₂₈₀测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μL）= (OD₂₆₀)×(稀释倍数n)×40。

8.本产品仅作科研用途！

使用方法

提示：

→第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!

→提取细菌RNA需先配制加了溶菌酶或者lysostaphin的TE(10 mM Tris-HCl， 1 mM EDTA)，TE中已加入溶菌酶或者lysostaphin，浓度为1mg/mL。

1.离心收集1-2mL菌液(10⁸-10⁹细胞)到一个1.5 mL离心管, 尽可能去除上清，注意残留的上清不能超过20μL/每使用100μL TE(见下面步骤2)。

2.根据细胞的种类和数量，充分重悬细胞在100μL(5×108细胞)/ 200μL(5×10⁸-7.5×10⁸细胞) TE中(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA)，TE中已加入溶菌酶或者lysostaphin，浓度为1mg/mL，或者直接用TE重悬后，用干净枪头挑取少许溶菌酶加入。

3.室温(15-25℃)温育5分钟/溶菌酶, 或者37℃温育15分钟/ lysostaphin，破解细胞壁。每2分钟涡旋振荡10秒帮助破壁。

注意各种细菌破壁的难易程度不一样,一般革兰氏阴性菌使用上面的条件就足够了，甚至可能省略该步骤，但是某些阳性难破壁需要提高溶菌酶浓度或者使用lysostaphin，玻璃珠机械破壁,蛋白酶K消化或者联合使用等方法， 需要根据用户自己的具体情况调节酶的工作浓度和温育温度、时间和选择正确的方法。

4.加入350μL（如果上面使用100μL TE/酶）或者700μL（如果上面使用200μL TE/酶）裂解液RLT，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。

一般加入裂解液后充分涡旋吹打后应该见不到明显团块或者不溶物，极少数情况下如果有明显团块或者不溶物可以将裂解物13，000rpm离心3分钟，沉淀不能裂解的碎片或者不溶物，将裂解物上清全部转到一个新离心管再进行下一步。

5.加入250μL 无水乙醇（曾加入100μL TE/350μL RLT管）或者500μL无水乙醇（曾加入200μL TE/700μL RLT管），立即吹打混匀。

6.立刻将混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心30秒，弃掉废液。

7.加700μL 去蛋白液RW1，室温放置30秒，13，000rpm 离心30秒，弃掉废液。如果DNA残留明显，可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。

8.加入500μL漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），13,000 rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μL漂洗液RW，重复一遍。

9.将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10.取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μL RNase free water， 室温放置1分钟，13,000 rpm 离心1分钟。

11.如果预期RNA产量>30μg，加30-50μL RNase free water重复步骤10，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。

洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。裂解液RLT Plus。最大处理量不超过10⁷个细胞。