价格:1,500
货号异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase,ICL)试剂盒
产品详情
产品详情
产品信息
产品名称 |
测定方法 |
产品编号 |
规格 |
异柠檬酸裂解酶(ICL)试剂盒 |
微量法 |
HRK2814 |
100管/96样 |
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
ICL(EC4.1.3.1)主要存在于植物和微生物中,油料作物种子在萌发过程中,通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物。ICL是乙醛酸循环的关键酶之一。
测定原理
ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸,乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD,NADH在340nm下有特征吸收峰,监测340nm吸光度的减小速率可间接反应ICL活性。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水
试剂组成和配制
提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体15mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存;
试剂三:液体360μL×1支,4℃保存;
试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存;
样本的前处理
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤
1.分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2.样本测定
(1)工作液的配置,将试剂二和试剂三转移至试剂一中,充分混合溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
(2)在试剂四中加入4mL蒸馏水,充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、150μL工作液和40μL试剂四,混匀,立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
ICL活性计算
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白中每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=1608×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=3.215×ΔA
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白中每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=3216×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=6.25×ΔA
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
注意事项
本产品仅作科研用途!