• 说明书丨HRbio™++qPCR+SYBR+Green+Master+Mix+(High+Rox+Plus).pdf

产品信息

产品描述

      HRbio™qPCR SYBR Green Master Mix(High Rox Plus)是 2×实时定量 PCR 扩增的预混合溶液。Mix 中含有热启动 HRbio™  DNA Polymerase 、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+及High Rox。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光 定量 PCR，大大简化操作过程，降低污染几率。

      本品采用的 DNA 聚合酶配体可以随温度变化实时调节 DNA 聚合酶活性。配方添加了有效抑制非特异性 PCR 扩增的因 子和提升 PCR 反应扩增效率的因子， 使定量 PCR 可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

适用机型

Applied Biosystems: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT FAST, StepOne, StepOne Plus.

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃保存，有效期18个月。

本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料 SYBR Green I，保存或配制反应体系时需避免强光照射。

注意事项

1）解冻后Master Mix可能出现絮状物质， 4℃放置并上下颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。

2）推荐使用本公司cDNA合成试剂盒（货号：HRF0182），以有效去除 RNA 样品中残留的基因组。

3）为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

4）本产品仅作科研用途！

反应体系

【注】： 使用前务必充分混匀， 避免剧烈震荡产生过多气泡。

a)  引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在 0.1- 1.0 μM 之间进行调整。

b)  模板浓度：如模板类型为未稀释 cDNA 原液，使用体积不应超过 qPCR 反应总体积的 1/10。

c)  模板稀释：cDNA 原液建议 5- 10 倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的 CT 值在 20-30 个循环为好。

d)  反应体系：推荐使用20 μL 或 50 μL ，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

e)  体系配制：请于超净工作台内配制， 并使用无核酸酶残留的枪头、反应管； 推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染 和

气溶胶污染。

扩增程序 （两步法）

扩增程序 （三步法）

【注】高特异性可选择两步法，高效率扩增可选择三步法。

a)  预变性时间： 根据不同模板和引物的具体情况可适当缩短至 2 min。

b)  退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。

c)  荧光信号采集（ ★）：请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：

30sec 以上：

Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96

31sec 以上： Applied Biosystems: 7300

34sec 以上： Applied Biosystems: 7500

d)  熔解曲线： 通常情况下可以使用仪器默认程序。

结果分析

定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。

1）扩增曲线：

标准扩增曲线为 S 型。

Ct 值落在 20-30 之间时， 定量分析最准确；

Ct 值小于 10 ，需要将稀释模板后，重新进行实验；

Ct 值介于 30-35 之间时， 需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；

Ct 值大于 35 时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。

2)  熔解曲线：

熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。 熔解曲

线出现双峰，需要通过 DNA 琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。

如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。

如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。

引物设计指南

1.推荐引物长度25 bp 左右。扩增产物长度 150 bp 为佳，可以在 100 bp-300 bp 内选择。

2.正向引物和反向引物的 Tm 值相差不宜超过 2℃ 。引物 Tm 值 60℃-65℃为佳。

3.引物碱基分布要均匀， 避免出现连续的 4 个相同碱基， GC 含量控制在 50%左右。 3’端最后一个碱基最好为 G 或 C。

4.引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有 3 个碱基以上的互补序列。

5.引物特异性需要用 NCBI BLAST 程序进行核对。避免引物 3’端有 2 个碱基以上的非特异性互补。

6.设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

实验案例