• 说明书丨HRQ0651-EndoFree+Plasmid+Mini+Kit无内毒素质粒小量快速提取试剂盒.pdf

产品信息:

产品描述：

 本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，通过独特的内毒素清除剂选择性结合离心除去内毒素，然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

产品特点：

1.离心吸附柱内硅基质膜采用进口的特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。

2.独特工艺配方清除内毒素，内毒素含量极低（<0.1 EU/μg DNA），细胞转染效果极佳。也可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序、等各种分子生物学实验。

储存事项：

1、RNase A保存在即用型甘油缓冲液中，常温运输，收到后，不超过25℃室温至少保存6个月，4℃保存12个月，长期保存放-20℃。

2、第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入Buffer P1后（终浓度100ug/ml）置于2-8℃保存。如果Buffer P1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA残留，在Buffer P1中补加RNase A即可。

3、环境温度低时Buffer P2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

4、避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品组分：

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

内毒素清除剂常温运输，4℃可以保存一个月，长期保存放-20℃。

注意事项：

1、所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2、提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒，建议接种单菌落于1.5-4.5 ml加合适抗生素的LB培养基， 过夜培养14-16个小时，可提取出多达20µg-50µg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应适当加大菌体使用量，使用5-10 ml过夜培养物，同时按比例增加P1、P2、N3的用量，其它步骤相同。

3、得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD₂₆₀值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关

。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。

4、质粒DNA确切分子大小， 必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。

5、洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在－20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

提示：

第一次使用前请先在Buffer PE瓶中加入指定量无水乙醇，充分混匀，作好标记，以免多次加入!

将RNase A全部加入Buffer P1中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。

1、取1.5-4.5 mL过夜培养的菌液，12,000 rpm离心30秒，尽可能的倒干上清，收集菌体。

2、用250μL的Buffer P1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。  

3、加250μL的Buffer P2，温和地上下翻转6 -8次使菌体充分裂解，室温放置4分钟。

4、加250μL的Buffer N3，立即温和地上下翻转6 -8次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀。12,000 rpm离心10分钟，小心取上清至新管，避免吸取到漂浮白色沉淀。

5、加入0.1体积(上清的体积的10%，约80µL)的内毒素清除剂到上一步所得上清中，颠倒旋转混匀，冰浴或者插入碎冰中(或冰箱冷冻室)放置5分钟直到浑浊变清亮透明（或仍旧稍有浑浊），中间偶尔混匀几次。

6、常温放置3-5分钟，温度恢复室温溶液很快变为浑浊，颠倒混匀。

7、室温12,000 rpm离心10 分钟。上层水相含DNA，下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新的离心管中（注意不要吸到蓝色油状层，里面含内毒素等杂质），弃油状层。

8、向上层水相中加入0.5体积异丙醇（约370µL）后充分颠倒混匀后分两次（每次不超过700µL）转入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm离心1分钟，弃废液。

9、加入500μL的Buffer PB，12,000 rpm 离心30秒，弃废液。

10、加入600μL的Buffer PE（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。再加入600μL的Buffer PE，12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。

11、将吸附柱放回空收集管中，12,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液Buffer PE， 以免漂洗液Buffer PE中残留乙醇抑制下游反应。

12、取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50-100μl洗脱缓冲液Buffer EB（洗脱缓冲液Buffer EB事先在 65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12,0

00 rpm 离心1分钟，质粒既收集在离心管中。

注意1：如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，离心1分钟。

注意2：洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于30μl，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。