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产品描述

      His-Tag 蛋白纯化试剂盒是由His蛋白纯化琼脂糖磁珠，经过优化预制的缓冲液以及50mL的磁力架组成，用于纯化各种表达系统融合表达的His重组蛋白。

使用说明

1.样品准备

以大肠杆菌表达系统为例

1). 4℃离心30 min（4000 g）收集菌体，弃上清。

2). 用冷结合/平衡缓冲液重悬细胞, 如果需要，可加入适量的抑制剂，如蛋白酶抑制剂（PMSF）或其他蛋白酶抑制剂等。

注意：加入的抑制剂不能对His蛋白纯化琼脂糖磁珠的性能有影响，破碎液中不能含有EDTA、EGTA 等螯合剂，DTT、巯基乙醇等还原剂，尿素、盐酸胍等变性剂。

3). 用超声波破碎法在冰上破碎菌体，直到样品破碎完全。

可选：如果裂解物太粘稠，可以加入RNase A（终浓度10 μg/mL）和DNase I（终浓度5 μg/mL）并在冰上孵育10-15 min。

4) 4℃离心20 min（12,000 g），除菌过滤，并小心将上清和沉淀分离。

5).用SDS-PAGE 分析His融合蛋白的含量及可溶性。

2. 纯化重组His融合蛋白

1). 将His蛋白纯化琼脂糖磁珠充分混匀，使用移液器取适量的磁珠悬浮液，置于离心管中，磁性分离,弃上清。

2). 加入与上述磁珠悬浮液等体积的结合/平衡缓冲液，使用移液器反复吹打5-10次，磁性分离，弃上清，重复洗涤2次。

3). 将制备好的含有His 融合蛋白澄清菌液加入到处理好的磁珠中，颠倒混匀。将离心管置于混匀仪上，室温孵育30min。(也可置于2-8℃孵育1h或者过夜）

4). 结合结束后，将离心管置于磁力架上，磁性分离，弃上清（保留，以备检测）。向离心管中加入2-5倍悬浮液体积的洗涤液，移液器反复吹打5-10次，然后磁性分离，用移液器吸取上清（保留，以备取样检测）。重复上述步骤3次。

5). 洗脱蛋白时可根据需要调整洗脱体积从而调整蛋白浓度的目的。建议用2-5 倍柱体积的洗脱缓冲液加入到离心管中，移液器轻轻吹打3-5次，混匀，磁性分离，然后用移液器吸取上清液，即为目的蛋白。如有需要，可以重复上述步骤1次，以提高蛋白回收量。

6). SDS-PAGE检测纯化效果，将PAGE胶取下放入塑料器皿中，加入适量蛋白快速染色液覆盖PAGE胶, 然后至于摇床上摇动，染色时间0.5h-2h或过夜均可。

7）染色结束后，PAGE胶放置于水中保存并拍照。

3.  磁珠再生

将装有磁珠的离心管中加入1mL 洗脱缓冲液，用移液器反复吹打3-5次，使磁珠重复悬浮，然后置于磁力架，磁性分离，弃上清，重复该操作2次。向离心管中加入1mL去离子水，用移液器反复吹打3-5次，使磁珠重复悬浮，然后置于磁力架，磁性分离，弃上清，重复该操作2次。最后加入20%乙醇中，使总体积等于初始悬浮液体积，置于 2-8°C 保存。

储存条件

置于2-8℃中保存。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）本产品仅作科研用途！