• Minute ™质膜蛋白和细胞组分分离试剂盒 SM-005_CN.pdf

产品信息

产品描述

      Minute 膜蛋白提取试剂盒通过离心管柱技术配合特定裂解液可以快速从动物细胞或组织中分离天然的膜蛋白。其原理是细胞/组织通过Buffer A致敏，然后细胞以Z字形路径通过离心管柱。在这个过程中细胞膜会破裂，分离出完整的细胞核，因此最终获得的膜蛋白中不含有核膜和核蛋白污染。通过差速离心和密度离心可以把细胞蛋白分为：总膜，细胞核，细胞质，细胞器及质膜，而无需超高速离心。整个操作过程不超过45分钟即可完成。

应用

      SDS-PAGE、immunoblottings、ELISA、IP、膜蛋白结构分析、MS、2-D、酶活性检测等其他应用。

使用说明

膜组分分离步骤

A.总膜组分分离

1.将离心管柱及接收管套管放置冰上预冷

2.细胞样品，低速离心（500-600Xg，5 分钟）收集 1-50 x106 个细胞。接转 3a 步骤。组织样品， 接转 3b 步骤。（贴壁细胞样品建议使用细胞刮刀收集，尽量不使用胰酶消化）

注意：从细胞样品中分离质膜组分，建议细胞量为 20-50 X 106 个细胞。

3-a. 用预冷的 PBS 清洗一次细胞。去除上清，在 Buffer A 中重悬细胞（起始细胞数小于 5X 106 加入 200ul BufferA，起始细胞数大于 5x106 加入 500ul Buffer A）。冰上孵育 5-10 分钟。涡旋大力震 荡 10-30 秒。迅速将细胞悬液转入离心管柱中。接转步骤 4.

3-b. 组织样品，将新鲜组织（10-30mg）或冷冻组织（20-30mg）放置于离心管柱上。加入 200ul Buffer A，用塑料棒反复扭转研磨组织 1 分钟（注意：如果你的样品是骨骼或是心肌，建议在研磨前加入 100-200mg 组织分离粉）。再加入 300ul Buffer A，用吸头吹打几次后，开盖冰上孵育 5 分钟。接转步骤 4.

注意：存在少量的非均质组织不会影响样品的质量。塑料棒可重复使用。用 75%酒精擦拭或用蒸馏水冲洗干净。

4.盖上盖子， 16,000Xg，离心 30 秒。（此步骤推荐使用可在 10S 内达到离心力的台式离心机，离心机的离心力和升速时间会影响膜组分得率）

优化：细胞样品建议第 4 步完成后再次重悬细胞，转移回离心管柱中，16,000Xg 再次离心 30 秒， 重复此步骤可以增加 20-30%产量。

5.弃去离心管柱，涡旋大力震荡 10 秒重悬细胞。

以下步骤将细胞分为四组分：细胞核、细胞质、细胞器和质膜。

6.700Xg，离心 1 分钟（沉淀是完整的细胞核）。将上清转移到新的 1.5ml 离心管中，4℃，16000Xg离心 10-30 分钟（延长离心时间可以增加产量），弃去上清（上清为胞浆组份），保存沉淀（沉淀 为总膜组份包括细胞器和质膜）。如果不需要分离质膜做到此步骤即可，产量一般为 10-500ug/样品。可将总膜组份存储于-70℃或者根据下游实验选择溶解液溶解。如果需要提取质膜，请不要冷冻总膜组份。分离质膜继续第 7 步骤。

B.质膜组分分离

7.加入 200ul Buffer B 用吸头反复吹打或涡旋震荡重悬总膜组份。4℃，7800Xg，离心 5 分钟（注意：如果最终质膜组份中含有细胞器膜污染，此步骤离心时间可增加到 20 分钟提高纯度，第一次使用建议按照说明书操作，无需调整离心时间）。沉淀部分为细胞器。

8.小心的将上清液转移到新的 2.0ml 离心管中，加入 1.6ml 预冷的 PBS 混匀几次(此步 1.6ml PBS 用于调整溶液密度，不可减量)。16000Xg，离心 15-30 分钟（延长离心时间可以增加产量）。弃去上清液，保存沉淀（沉淀为质膜）。产量一般为 10-300ug/样品。质膜沉淀可以根据下游实验需求用 20-200ul 含表面活剂的缓冲液溶解。推荐使用下表中 MinuteTM 系列溶解液溶解膜组分。做等电聚焦（2D 凝胶第一维）我们建议使用：7M 尿素/2M 硫脲/2%Chaps 和 20mM DTT (使用前将 DTT加入以上混合液中)。

储存条件

-20℃下储存。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）本产品仅作科研用途！