• 说明书丨HRN0031-无内毒素质粒大量快速提取试剂盒.pdf

产品信息

产品描述

      本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，粗提物通过采用高效的去内毒素系统除去内毒素，然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

      每次可处理100-200 ml 细菌培养液，理论上最多可提取2mg质粒DNA

产品组分

产品特点

1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用高品质特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。

2.不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速， 方便，从100-200 mL大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取0.5-2mg纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达80-90 %。

3.本试剂盒提取的质粒DNA，内毒素含量极低（<0.1 EU/μg DNA），细胞转染效果极佳。也可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序、等各种分子生物学实验。

运输和保存方法

1）本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

2）第一次使用时，将试剂盒所带全部的RNase A加入Buffer I后（终浓度100ug/mL）置于4℃保存。如果Buffer I中RNase A失活，提取的质粒可能会混杂有微量RNA残留，在Buffer I中补加RNase A即可。

3）环境温度低时Buffer II中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

4）避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

注意事项

1.所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成，使用转速可以达到12,000 x g，带50 mL转头的 台式离心机。

2.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加Buffer I、Buffer II、Buffer III 的用量，洗脱缓冲液应在70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间，以增加提取效率。

3.得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/mL DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。

4.质粒DNA确切分子大小， 必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。

5.洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱，质粒应该保存在－20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

使用方法

提示：

→第一次使用前请先在Buffer PW中加入84 mL无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

→将RNase A加入Buffer I中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。

1、取100 ml-150ml（低拷贝200 ml-250ml）过夜培养的菌液加入离心管， 8,000 rpm 离心 3 min收集细菌，弃上清。

2、加入 10 ml Buffer I（请先检查是否已加入 RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮沉淀。

3、加入 10 ml Buffer II，立即温和地上下翻转 6-8 次（不要剧烈震荡），使菌体充分裂解，室温放置 5 min。

4、向离心管中加入 10 ml Buffer III，立即温和地上下翻转 6-8次（溶液加完后应立即上下翻转，以避免产生局部沉淀），充分混匀，至溶液出现白色、分散絮状沉淀。室温放置 10 min后，再8,000 rpm 离心 10 min。

5、将步骤 4 的离心上清全部溶液转移至内毒素吸附过滤柱中（请避免倒入大量沉淀，以免阻塞过滤器），缓慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的 50 mL 的管中。

6、向滤液中加入 0.3 倍滤液体积的Buffer PI，0.1倍滤液体积的 Buffer ER，上下颠倒混匀后转移到吸附柱中（吸附柱放入 50 ml 收集管中）。

1. 注意：过滤后滤液会损失，根据损失的不同请加入不同体积的异丙醇。吸附柱的最大容积为 20 ml，所以需要分多次过柱。个别情况下离心机转子倾角较大，此时，建议加入吸附柱的溶液体积不超过 15 ml，以防产生漏液现象。

7、8,000 rpm 离心 2 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

8、向吸附柱中加入10mL去蛋白液 Buffer PB，8,000 rpm 离心 2 min。

9、 向吸附柱中加入10 ml  Buffer PW，8,000 rpm 离心 2 min，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

10、重复操作步骤9。

11、向吸附柱中加入 3 ml Buffer PE，室温 8,000 rpm 离心 2 min，弃废液。

12、将吸附柱重新放回收集管中，8,000 rpm 离心 5 min，以去除残余的漂洗液。

13、打开吸附柱盖子，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

14、将吸附柱置于干净的 50 ml 收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 1-2 ml Buffer TE，室温放置 2 min，然后 8,000 rpm 离心 2 min。将离心下来的质粒 DNA 全部移入到干净的 1.5 ml 离心管，-20℃保存。