• Minute™ 哺乳类动物组织及细胞总脂筏分离试剂盒 LR-039_CN.pdf

产品信息

产品描述

      脂筏是富含高水平胆固醇和鞘磷脂的微质膜结构域。脂筏涉及许多细胞过程，包括但不限于信号转导，膜运输和蛋白质分选。脂质修饰的蛋白质和一些跨膜蛋白质集中在脂筏中，而其他蛋白质被排除在外。脂筏还与质膜上的Na+ / K+ ATP酶相关。传统的脂筏分离方法使用蔗糖密度法或OptiPrep密度法，采用超高速离心法分离，需要大量的起始样品，而且该方法繁琐、耗时。为了克服传统方法的缺点，我们利用离心管柱技术开发了这款简单、快速的脂筏分离试剂盒。首先将样品的总膜组分分离，然后用含有非离子表面活性剂的缓冲液处理，最后使用台式离心机离心分离耐表面活性剂组分。整个过程无需使用密度梯度和超高速离心，可以在90分钟内从培养的细胞/组织中高度富集脂筏。

使用说明

注意：实验前请将缓冲液 C 恢复常温，混匀备用。

1. 将离心管柱放入收集管中，放置在冰上预冷，缓冲液 A 和 B 放在冰上预冷，但请不要预冷缓冲液 C！
2. A.对于培养的细胞，通过低速离心（500-600×g，5 分钟）收集 30-40×10 6 个细胞。用预冷 PBS 洗涤细胞一次。完全除去上清液，将沉淀重悬于 500μl 缓冲液 A 中。将细胞悬浮液在冰上孵育 5 分钟，剧烈涡旋震荡 10-30 秒。立即将细胞悬浮液转移到离心管柱中。转到第 3 步。

B.对于柔软组织样本，将 30-40 mg 组织（新鲜或冷冻）放入离心管柱中。将 200μl 缓冲液 A 加入离心管柱中，用塑料棒反复扭转研磨组织，2-3 分钟。研磨后，再次加入 300μl 缓冲液 A。转到步骤 3。对于肌肉组织，将组织放在干净的玻璃或塑料板的表面上，用锋利的刀片将组织切成组织匀浆状。将组织转移到离心管柱中，并如上所述进行研磨。塑料棒是可重复使用的，用 70％酒精或水清洗干净即可。

3. 盖上离心管柱，倒置混匀几次，然后 16,000 xg 离心 30 秒。（此步骤推荐使用可在 10S 内达到离心力的台式离心机，离心机的离心力和升速时间会影响最终得率）

4. 弃去离心管柱，剧烈涡旋 10 秒钟重悬沉淀。1000×g 离心 5 分钟（沉淀物包含细胞核，大细胞碎片和一些未破裂的细胞）。

5. 将所有上清液转移到新鲜的 1.5ml 离心管中，16,000×g，4 度，离心 30 分钟。沉淀是总膜。小心地将所有上清液（胞浆部分）转移到新的 1.5ml 管中，如果需要胞浆组分保存即可。

6. 沉淀中加入 500μl 预冷缓冲液 B，重复上下吸打 20-30 次，并剧烈涡旋 10 秒重悬。立刻在冰上孵育 30分钟，期间每隔 10 分钟涡旋震荡一次，并立即将管子放回冰上，使其始终保持冷却。

7. 将离心管 16,000×g 离心 10 分钟。将上清液转移到新的 1.5ml 离心管中，向管中加入 0.5ml 缓冲液 C 并通过短暂涡旋震荡充分混合（管中的溶液变得混浊）。将管在冰上孵育 2 分钟。10,000 X g 离心 10 分钟。离心后，脂筏漂浮在管的顶部。

8. 将一个细的吸管头（如 SDS-PAGE 样品加样针）插到移液器上，插入管子底部，缓慢并完全地去除水相。或者，也可以使用配备 21 号针头的 2 毫升注射器。去除水相后，脂筏会粘附在离心管壁上。

9. 16000 x g 离心 5 分钟。完全除去上清液。沉淀是分离的脂筏，可使用下面列出的溶解液 50-200μl 重悬，或者根据下游应用情况选择其他缓冲液重悬。根据细胞/组织类型不同，最终蛋白质产量在 30-100 ug/样品范围内。

储存条件

4℃下储存。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）本产品仅作科研用途！