价格:5,266
货号Minute™ 哺乳类动物组织及细胞总脂筏分离试剂盒
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产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格/元 |
Minute™ 哺乳类动物组织及细胞总脂筏分离试剂盒 | LR-039 | 20Tests | ¥5266 |
产品描述
脂筏是富含高水平胆固醇和鞘磷脂的微质膜结构域。脂筏涉及许多细胞过程,包括但不限于信号转导,膜运输和蛋白质分选。脂质修饰的蛋白质和一些跨膜蛋白质集中在脂筏中,而其他蛋白质被排除在外。脂筏还与质膜上的Na+ / K+ ATP酶相关。传统的脂筏分离方法使用蔗糖密度法或OptiPrep密度法,采用超高速离心法分离,需要大量的起始样品,而且该方法繁琐、耗时。为了克服传统方法的缺点,我们利用离心管柱技术开发了这款简单、快速的脂筏分离试剂盒。首先将样品的总膜组分分离,然后用含有非离子表面活性剂的缓冲液处理,最后使用台式离心机离心分离耐表面活性剂组分。整个过程无需使用密度梯度和超高速离心,可以在90分钟内从培养的细胞/组织中高度富集脂筏。
使用说明
注意:实验前请将缓冲液 C 恢复常温,混匀备用。
1. 将离心管柱放入收集管中,放置在冰上预冷,缓冲液 A 和 B 放在冰上预冷,但请不要预冷缓冲液 C!
2. A.对于培养的细胞,通过低速离心(500-600×g,5 分钟)收集 30-40×10 6 个细胞。用预冷 PBS 洗涤细胞一次。完全除去上清液,将沉淀重悬于 500μl 缓冲液 A 中。将细胞悬浮液在冰上孵育 5 分钟,剧烈涡旋震荡 10-30 秒。立即将细胞悬浮液转移到离心管柱中。转到第 3 步。
B.对于柔软组织样本,将 30-40 mg 组织(新鲜或冷冻)放入离心管柱中。将 200μl 缓冲液 A 加入离心管柱中,用塑料棒反复扭转研磨组织,2-3 分钟。研磨后,再次加入 300μl 缓冲液 A。转到步骤 3。对于肌肉组织,将组织放在干净的玻璃或塑料板的表面上,用锋利的刀片将组织切成组织匀浆状。将组织转移到离心管柱中,并如上所述进行研磨。塑料棒是可重复使用的,用 70%酒精或水清洗干净即可。
3. 盖上离心管柱,倒置混匀几次,然后 16,000 xg 离心 30 秒。(此步骤推荐使用可在 10S 内达到离心力的台式离心机,离心机的离心力和升速时间会影响最终得率)
4. 弃去离心管柱,剧烈涡旋 10 秒钟重悬沉淀。1000×g 离心 5 分钟(沉淀物包含细胞核,大细胞碎片和一些未破裂的细胞)。
5. 将所有上清液转移到新鲜的 1.5ml 离心管中,16,000×g,4 度,离心 30 分钟。沉淀是总膜。小心地将所有上清液(胞浆部分)转移到新的 1.5ml 管中,如果需要胞浆组分保存即可。
6. 沉淀中加入 500μl 预冷缓冲液 B,重复上下吸打 20-30 次,并剧烈涡旋 10 秒重悬。立刻在冰上孵育 30分钟,期间每隔 10 分钟涡旋震荡一次,并立即将管子放回冰上,使其始终保持冷却。
7. 将离心管 16,000×g 离心 10 分钟。将上清液转移到新的 1.5ml 离心管中,向管中加入 0.5ml 缓冲液 C 并通过短暂涡旋震荡充分混合(管中的溶液变得混浊)。将管在冰上孵育 2 分钟。10,000 X g 离心 10 分钟。离心后,脂筏漂浮在管的顶部。
8. 将一个细的吸管头(如 SDS-PAGE 样品加样针)插到移液器上,插入管子底部,缓慢并完全地去除水相。或者,也可以使用配备 21 号针头的 2 毫升注射器。去除水相后,脂筏会粘附在离心管壁上。
9. 16000 x g 离心 5 分钟。完全除去上清液。沉淀是分离的脂筏,可使用下面列出的溶解液 50-200μl 重悬,或者根据下游应用情况选择其他缓冲液重悬。根据细胞/组织类型不同,最终蛋白质产量在 30-100 ug/样品范围内。
储存条件
4℃下储存。
注意事项
1)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
2)本产品仅作科研用途!