• 说明书丨HR0424-EdU-488细胞增殖检测试剂盒(适用于FACS、FM).pdf

产品信息 

产品描述

      EdU-488细胞增殖检测试剂盒(FuHeng EdU Cell Proliferation Kit with AlexaFluor 488)，是一种利用核苷渗入法对细胞增殖情况进行快速、 简单、高灵敏检测的试剂盒。其原理为：试剂盒中的EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)是一种胸苷(T)类似物，EdU可以在在 细胞周期的S期中替代胸苷掺入到新合成的DNA中；另一方面，EdU上的乙炔基能与叠氮 化物(如荧光探针Alexa Fluor 488 Azide)通过Cu+的催化发生共价反应，形成稳定的三唑 环，该反应非常迅速，被称作点击反应(Click reaction) (图1) 。通过点击反应，新合成的DNA会被绿色荧光标记，然后通过检测荧光信号实现细胞增殖的检测。

图1. EdU法中的点击反应原理图。 掺入到细胞DNA中的EdU与荧光探针或生物素等标记的叠氮化物，在铜离子的催化下发生共价反应，形成稳定的三唑环，使细胞DNA标记上荧光探针或生物素。

细胞增殖检测是评估细胞活性、遗传毒性及抗肿瘤药物效果等的基础实验手段。 细胞增殖检测的方法按照原理通常可以分为五类：膜损伤检测、代谢活性检测、ATP水平测定、 DNA合成检测和细胞荧光标记检测法。目前公认的最精确的检测细胞增殖的方法是直接检测细胞中DNA的合成，即核苷渗入法。以前常用的核苷渗入法是BrdU(胸腺嘧啶核苷酸类似物)法，但BrdU法的缺点是需要变性DNA后才能与抗体结合，导致了DNA双链结构的破坏，影响了其他染料的结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问题。 EdU法作为新型的核苷渗入法具有以下优点：

◆安全-----不使用[3H]thymidine，无放射性污染。

◆ 简单-----基于小分子化学反应的检测方法，简单高效，仅需三步： EdU孵育；细胞固定；荧光检测。无需DNA变性和孵育抗体。

◆ 快速-----无需过夜，省却抗原抗体反应。整个检测过程只需 2.5 小时，大大缩短实验周期。

◆ 准确-----标记率高且无需DNA变性(酸解、热解、酶解等)，可有效避免变性带来的样品损伤，确保细胞核边缘清晰完。

◆ 灵敏-----无需抗体，检测染料仅为BrdU抗体的1/500，更容易扩散，即使单个增殖细胞也能准确检测。

◆ 兼容-----对样品几乎无损伤，允许与多种抗体或荧光蛋白同时标记，能够同时检测细胞其他性状特征。

本试剂盒适用于培养的细胞或组织样品，也适用于组织切片，可以检测到细胞或组织样本中的单个增殖细胞，也可以对细胞或组织样本总体的细胞增殖情况进行定量分析。本试剂盒包含EdU法检测所需要的所有组份，同时提供了蓝色细胞核染料Hoechst 33342，可以用来复染所有细胞核，也可用于细胞周期分析。使用本试剂盒所做结果可以用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪进行检测， 也可以用于高内涵筛选(High-Content Screening, HCS)。

光谱特性：488-Azide：绿色荧光，Ex/Em=491/518 nm；Hoechst 33342：蓝色荧光， Ex/Em=346/460nm, bound to DNA。

产品组分

运输和保存方法

-20℃保存， 一年有效。488-Azide和Hoechst 33342(1000X)须避光保存。

使用方法

1. 需自备试剂

（1）10mM PBS, pH7.2-7.6

（2）固定液-----4%多聚甲醛in PBS 。

（3）洗涤液-----3% BSA in PBS , pH7.2-7.6。

（4）通透液-----0.3~0.5% Triton X-100 in PBS。

（5）去离子水或超纯水。

2.检测体系的确定

(1）以下操作步骤是以6孔板或常规切片检测体系为例的，如果使用其他容器，检测体系可以相应按比例调整，具体检测时Click反应液的使用量请参考表1。

(2）以下操作步骤是以贴壁细胞或组织切片为例的，如果检测的是悬浮细胞，请按常规 的悬浮细胞的操作方式进行，比如在相关步骤中增加离心步骤等。细胞数在10-100万的悬浮细胞可以使用500u的检测体系，可以根据细胞数的多少相应调整检测体系。

表1. Click反应液的使用量参考

3.EdU标记与固定、通透

3.1对于培养细胞

（1）将适当数量的待测细胞接种于6孔板中，培养过夜至恢复正常状态后，进行所需要的药物处理或者其它刺激处理。

（2）配制2XEdU工作液： 用完全培养基稀释EdU(10mM)至合适的浓度，配成2X的EdU工作液。例如，推荐的EdU工作液(1X)的终浓度为10μM，那么需要用完全培养液1:500稀释

EdU(10mM)至浓度为20μM，即配成2XEdU工作液(20μM)。

【注】EdU的使用浓度应根据所使用的的细胞类型做相应的优化，推荐用户以10μM的EdU初始浓度进行摸索优化， 一般的贴壁肿瘤细胞使用10μM就可以。细胞培养基种类、 细胞类型、 细胞生长密度和增殖速度等多方面因素都有可能影响EdU的掺入效果，因此建议用户在预实验中设置一系列的EdU浓度梯度，以确定最佳浓度。如果之前使用过BrdU进行实验，则可以参考BrdU的终浓度作为EdU的终浓度。您也可以参考附表1.细胞实验EdU孵育浓度及时间参考。

（3）37℃预热2XEdU工作液，等体积加入6孔板中，使6孔板中的EdU终浓度变为1X。例如如果终浓度为10μM ，6孔板中每孔原来有培养基1ml，则将1ml 2XEdU工作液(20μM)加入到每孔中。如果培养基原有体积过大， 可以先吸除适量的培养基，再加入与剩下培养基等体积的2XEdU工作液；或者可以增加EdU的浓度并减少工作液的体积，例如2ml培养液中加入220μl 10XEdU工作液(100μM)。

【注】更换所有的培养液可能会对细胞的增殖有影响，因此不建议更换所有的培养液。

（4）继续孵育细胞适当时间。该孵育时间的长短取决于细胞生长速率，通常宜继续孵育细胞周期10%左右的时间。您也可以参考附表2.常见细胞系EdU孵育时间参考。

【注】孵育时间小于45min时，建议提高EdU的浓度；孵育时间大于20h时，建议适当降低EdU的浓度。

（5）EdU标记完成后，去除培养基。

【注】若最后做流式检测，样本为贴壁细胞，则用胰酶将细胞消化下来，收集细胞 ，之后每一步去除液体的步骤都需要500-1000×g离心3-5min，

• 加入1ml 固定液，室温固定15-30min。

（7）去除固定液，以每孔1ml的洗涤液洗涤细胞3次，每次3-5min。

（8）去除洗涤液，加入1ml通透液，室温孵育10-15min。

（9）去除通透液，以每孔1ml的洗涤液洗涤细胞1-2次，每次3-5min。

（10）转步骤4。

3.2对于组织切片样本

可以通过注射或进食等方式进行动物体内的EdU标记。 以下是以小鼠为例的，其它动物体内EdU标记条件请参考相关文献，也可以参考附表3进行条件优化。

（1）用PBS配制成一定浓度的EdU ，对于小鼠，可按照10-200mg/kg的用量进行腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水。

【注】EdU具体用量与动物的种类、体重和使用方式有关， 可以参考相关文献， 因此建议用户在预实验中设置一系列的EdU浓度梯度，以确定最佳浓度。推荐用户以50mg/kg的EdU初始浓度进行摸索优化。如果之前使用过BrdU进行实验，则可以参考BrdU的终浓度作为EdU的终浓度。或者直接使用50mg/kg的浓度进行测试。 也可以参考附表2。

（2）EdU标记4小时后或根据特定实验确定的适当时间后，快速处死小鼠，取出所需组织，按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。 EdU标记的时间也根据相关参考文献自行调整。

（3）对于冰冻切片：

1. 加入适量固定液，室温固定15min。
2. 去除固定液，用适量洗涤液洗涤3次， 每次3-5min。
3. 去除洗涤液，加入适量通透液，室温孵育10-15min。
4. 去除通透液，用适量洗涤液洗涤1-2次， 每次3-5min。
5. 抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫荧光染色，并有必要进行抗原修复， 可以使用适当的抗原修复液进行抗原修复处理。
6. 转步骤4。

（4）对于石蜡切片：

5min，换新的无水乙醇3min 。95%乙醇3min。85%乙醇3min 。75%乙醇3min 。50%乙醇

3min。PBS 5min。

1. 抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫组化染色，可以使用适当的抗原修复液进行抗原修复处理。

【注】如果使用蛋白酶K或胰酶进行抗原修复，修复后须反复洗涤干净，避免残留的酶干扰后续标记反应。

1. 转步骤4。

4.EdU检测

【注】本参考步骤每个样品的反应体系为500μl的Click反应液。用户可根据自己的样本情况参考表1适当调整。对于切片，可以根据切片大小，每个切片使用100-200μl的Click反应液， 其余步骤相同。

（1）配制Click-iT Additive Solution： 对于HR0424，用1.3ml去离子水/管溶解Click-iT

Additive；对于HR0424-L ，用10.4ml去离子水/瓶溶解Click-iT Additive 。混匀至全部溶解，即为Click-iT Additive Solution。配制后请按照每次用量适当分装，并-20℃保存，溶液一旦呈现棕色， 则说明有效成分降解不能再用。

（2）请参考下表配制Click反应液。

【注】请严格按照下表中组分顺序和体积配制Click反应液，否则Click反应可能无法有效进行。Click反应液须在配制后15分钟内使用。

（3）去除上一步骤中的洗涤液。每孔加入500μl Click反应液，轻轻摇晃培养板以确保

Click反应液可以均匀覆盖样品。

• 室温避光孵育30min。

（5）吸除Click反应液，以每孔1ml的洗涤液洗涤细胞3次，每次3-5min。

（6）此时增殖细胞被标记了明亮的绿色荧光。如无其它特殊要求，即可在荧光显微镜下观察，或者使用流式细胞仪（用500μl洗涤液重悬细胞后上机）、多功能酶标仪、高内涵筛选仪器(一般高内涵筛选需要细胞核复染)进行荧光检测分析。488-Azide的最大激发波长是491nm，最大发射波长是518nm 。如果需要检测细胞增殖的比例，可以参照步骤5对细胞核进行复染。

5.细胞核染色

（1）1X Hoechst 33342溶液的配制：用PBS按1:1000比例稀释Hoechst 33342(1000X)。

（2）吸除步骤5(5)洗涤液，每孔加1ml的1X Hoechst 33342溶液，室温避光孵育10min。

（3）吸除1X Hoechst 33342溶液，以每孔1ml的洗涤液洗涤细胞3次， 每次3-5min。

（4）随后即可进行荧光检测。 Hoechst 33342为蓝色荧光，最大激发波长为346nm，最大

发射波长为460nm。

注意事项

1. 羟基脲(Hydroxyurea)为 DNA 合成抑制剂，经过 10mM 羟基脲 提前 30min 处理的细胞，绿色荧光阳性的细胞几乎完全消失， 因此常被用作 EdU 实验的 阴性对照。
2. 配制好的 Click-iT Additive Solution 请根据每次用量适当分装后-20℃保存，避免反复冻融。Click-iT Additive Solution 融化后有白色物质析出为正常现象，请上下颠倒几次，待全部溶解后使用。溶液一旦呈现棕色， 则说明有效成分降解，不能再使用。
3. 皂苷促渗液可以用于全血及含红细胞的细胞悬液，以及其他含多种细胞类型的混合细胞悬液的通透。这种促渗液可以在裂解红细胞的同时，维持白细胞的光散射特性。
4. 本试剂盒做动物实验时可能需要更多的EdU，请根据实验需求用合适稀释液稀释后使用。
5. 由于本产品涉及到铜离子催化进行点击反应，请注意以下的兼容性问题及解决方案。本产品完全 兼容有机类染料如Alexa Fluor®系列普通染料及 fluorescein (FITC) 、Allophycocyanin (APC)及 APCE-tandems 染料；对于 Qdot®纳米晶体探针、Horseradishperoxidase (HRP)、R-phycoerythrin (R-PE)和 R-PE-tandems 染料如 Alexa Fluor® 680-R-PE 等，需要在点击反应完成后进行反应和检测； 本产品会影响 GFP、RFP、mCherry等荧光蛋白的荧光，对于荧光类蛋白如 GFP、TC-FlAsH™和 TC-ReAsH™类试剂，需要在点击反应前进行反应和检测。 Phalloidin (鬼笔环肽)不兼容点击反应，在检测细胞微管时请选用其它探针。
6. 如需在传统流式仪上进行总 DNA 含量的检测， 可采取低流速检测。DNA 含量检测所用荧光检测信号应与 DNA 含量成线性关系。EdU 标记信号呈现对数放大可以很好的被检测到。
7. 为了您的安全和健康，操作时请穿着实验服并佩戴一次性手套.
8. 本产品仅供科研用途！