• 说明书丨HR0223-1-一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光）.pdf

产品信息 

产品描述

        细胞凋亡（Apoptosis）的一个显著特点是细胞染色体DNA的降解，在一些内源性核酸内切酶的作用下，核小体间的DNA被切断，从而产生不同长度的寡聚核小体片段，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的180-200bp DNA Ladder图谱，而坏死细胞的DNA呈弥漫的连续图谱。

       荷瑞一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒 (One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit) 采 用TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick End Labeling)方法。其原理为：末端脱氧核糖核苷酸转 移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)在凋亡细胞断裂DNA的3´-羟基(3´-OH)末端催化掺入荧光素-12-脱氧三磷酸尿苷(FITC-12-dUTP) 。FITC-12-dUTP标记的DNA可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量检测。

      本试剂盒灵敏度高、特异性强、使用方便快捷。对于经过固定和洗涤的组织样本（石蜡切片、冰冻切片）和细胞样本（贴壁细胞、悬浮细胞），只需经过一步染色，洗涤后便 可以进行凋亡检测。本试剂盒还提供了DNase I阳性对照和Proteinase K，以便操作。以50μl加样量为标准，HR0223-1可测定20次，HR0223-2可测定50次。

产品组分

运输和保存方法

-20 ℃保存， 一年有效。FITC-12-dUTP Labeling Mix需避光保存。

使用方法

一、样本预处理：

1.1 石蜡包埋组织切片

① 脱蜡：室温下将石蜡切片放入二甲苯中浸泡 5-10 分钟，更换新鲜的二甲苯再浸泡 5-10分钟，以彻底脱掉石蜡。

② 水化：在无水乙醇中浸泡5分钟，更换新鲜的无水乙醇再浸泡5分钟。在梯度乙醇(90、80、70%)中各浸洗 1 次， 每次 3 分钟， 逐渐增加水分。

③ 洗涤：用PBS或HBSS轻轻润洗切片，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。此时

可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，以便后续操作。在实验过程中，切勿使样

品干燥，处理好的样本应放于湿盒中保持湿润。

④ 通透：用 PBS 按照1:100的比例稀释Proteinase K (2mg/ml),使其终浓度为20µg/ml。每

个样本上滴加100 µl的Proteinase K(20µg/ml),使溶液覆盖全部样本区域，20-37℃孵育15-30

分钟。【注】：Proteinase K有助于后续步骤中染色试剂的通透。孵育时间过短可能造成透性不充分从而影响标记效率，孵育时间过长则会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载玻片上脱落的风险。为得到最好的结果，需要自行优化 Proteinase K 孵育的温度和时间。

⑤ 洗涤：用PBS或HBSS润洗样本2-3次，轻轻吸干多余液体，处理好的样本放在湿盒中保持湿润。

【注】Proteinase K 需洗涤干净，以免干扰后续标记反应。

1.2 组织冰冻切片

① 固定：取出冰冻切片，并回温至室温。在组织固定液4%多聚甲醛（配制于新鲜的PBS）中浸

泡，室温下固定30分钟。

② 洗涤：轻轻吸干多余液体，并将切片浸没在PBS或HBSS中，室温孵育 10-15分钟。按此步骤重复洗涤一次，然后轻轻吸干多余液体。此时可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓

，以便后续操作。在实验过程中切勿使样品干燥，处理好的样本应放于湿盒中保持湿润。

③ 通透：用PBS 按照1:100的比例稀释Proteinase K(2mg/ml)，使其终浓度为 20µg/ml。每个样本上滴加100µl的 Proteinase K(20µg/ml)，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育10分钟。【注】：

Proteinase K 有助于后续步骤中染色试剂的通透。孵育时间过短可能造成透性不充分从而影响标 记效率，孵育时间过长则会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载玻片上脱落的风险。为得到最好的结果，需要自行优化 Proteinase K 孵育的温度和时间。

④ 洗涤：在 PBS 或 HBSS 中浸没洗涤样本 2-3 次，并用滤纸轻轻吸干多余液体。处理好的样

本放在湿盒中保持湿润。【注】：Proteinase K需洗涤干净，以免干扰后续标记反应。

1.3 贴壁细胞或细胞涂片

① 洗涤：取出制备好的细胞爬片、涂片或是细胞贴壁良好的培养板，用PBS 或HBSS洗涤一次。

② 固定：加入组织固定液或4%多聚甲醛（配制于新鲜的PBS），室温下固定 30 分钟。

③ 洗涤：用 PBS 或 HBSS 洗涤一次。

④ 通透：在样本上滴加适量通透液（建议使用含0.3%Triton X-100的PBS），使溶液覆盖全部

样本区域，室温孵育5分钟。【注】：Triton X-100有助于后续步骤中染色试剂的通透。孵育时间过短可能造成透性不充分从而影响标记效率，孵育时间过长则会增加细胞在后续洗涤步骤中脱落的风险。为得到最好的结果，需要自行优化通透温度和时间。

⑤ 洗涤：用PBS或HBSS洗涤 2-3次。【注】：通透液需洗涤干净，以免干扰后续标记反应。

1.4 悬浮细胞或细胞悬液

① 洗涤：离心收集细胞（建议 50 万~200 万个细胞），用 PBS 或 HBSS 洗涤一次。

② 固定：加入组织固定液或4%多聚甲醛（配制于新鲜的PBS），室温下固定 30分钟。【注】：

为防止细胞聚团，应置于摇床上缓慢摇动进行固定。

③ 洗涤：用PBS或HBSS洗涤一次。

④ 通透：加入适量通透液（建议使用含0.3% Triton X-100的PBS）重悬细胞，室温孵育5分钟。【注】：Triton X-100有助于后续步骤中染色试剂的通透。孵育时间过短可能造成透性不充分从而影响标记效率，孵育时间过长则会增加细胞破裂的风险。为得到最好的结果，需要自行优化通透温度和时间。

⑤ 洗涤：用PBS或HBSS洗涤2-3次。【注】：通透液需洗涤干净，以免干扰后续标记反应。

2.DNaseI处理阳性对照(可选)

①用去离子水按1:10的比例稀释10×DNase I Buffer（例如:每个样本需用 200µl 1×DNase I

Buffer，即用20µl 10×DNase I Buffer和180µl去离子水混合稀释），取其中100µl滴加到已通透的样本上，室温孵育5min。向剩余100μl 1×DNase I Buffer中加1μl DNase I (0.5mg/ml)，使其终浓度为 5µg/ml。

②轻轻叩掉或吸掉液体，加入100μl含 5µg/ml DNase I的缓冲液，室温孵育10min。

③ 用PBS或HBSS洗涤 3-4 次。

【注】：DNase I处理固定的细胞会引起染色体 DNA 的断裂，产生许多可标记的 DNA 3’末端，经上述流程处理后通常会引起大多数细胞显现绿色荧光。

3. 配制TUNEL检测液

计算好样本数量（包括实验组和阳性对照组），参考表1配制适当量的TUNEL检测液，即用即配，

注意避光。对于涂片、切片或 96 孔板的一个孔，所需体积是50μl，用50μl乘以实验和阳性对照反应的数目来确定所需TUNEL检测液的总体积。对于表面积更大的样本（如48 孔板、24 孔板、

12 孔板、6 孔板的一个孔），可成比例的增大试剂体积。

表 1. 准备用于实验的和可选阳性对照反应的TUNEL检测液

【注】：阴性对照体系为不含 TdT Enzyme 的 TUNEL 检测液，即用 ddH2O 替代 TdT Enzyme (10×)。如果 TUNEL 反应过强造成荧光背景高，可以用本试剂盒提供的 TdT Dilution Buffer 稀释 TdTEnzyme(10×)，即配制TUNEL 检测液时，减少 TdT Enzyme (10×)的量，加入相应量的 TdT Dilution Buffer。

4.标记与检测

4.1 组织切片、贴壁细胞或细胞涂片：

①在样本上滴加 TUNEL 检测液。如果待检样本为涂片、切片或在 24 孔板、12 孔板、6 孔板中

，可以使用防蒸发膜，或自行用自封袋或其他适当材料裁剪成比孔略小的圆形塑料 片，滴加TUNEL检测液后覆盖在样本上，可以使TUNEL 检测液覆盖更均匀，并且防止蒸发。也可以用PAP Pen圈出一个区域进行染色。载玻片需置于湿盒内，细胞培养板中多余的孔和多孔板的空隙中加入适量水以保持湿润。

② 37℃避光孵育60分钟。

③ PBS或HBSS洗涤2-3次。

④ 用抗荧光衰减封片剂封片后，在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为 450-500nm，

发射波长范围为515-565nm (绿色荧光)。

4.2 悬浮细胞或细胞悬液

① 用50μl TUNEL检测液重悬细胞。

② 37℃避光孵育60分钟，每隔15分钟用微量移液器轻轻重悬细胞。

③ PBS或HBSS洗涤2次。

④ 用250-500μl PBS或HBSS重悬细胞。

⑤用流式细胞仪分析细胞或者涂片后在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。

注意事项

1.配制TUNEL检测液之后的步骤注意避光操作。

2.若配制 TUNEL 检测液操作时间较长，请将 TdT Enzyme (10×) 、FITC-12-dUTP Labeling Mix和配好的检测液置于冰上暂时保存。

3.需自备PBS或HBSS，抗荧光衰减封片剂，组织固定液或 4%多聚甲醛，Triton X-100，二甲苯，无水乙醇等。

4.PBS或HBSS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去 PBS或 HBSS溶液后再进行下一步反应。

5.结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量 DNA片断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA 断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止 TdT 进入胞内反应，进而产生假阴性结果。

6.为了您的安全和健康，操作时请穿着实验服并佩戴一次性手套。

7.本产品仅供科研用途！