产品信息

产品描述

天然蛋白A（Protein A）是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白，与分离自G型或C型链球菌属的蛋白G类似，主要通过与免疫球蛋白（Ig）的Fc区相互作用，结合大多数哺乳动物的IgG，可用于多种抗体（单抗和多抗）的分离纯化。在与不用的免疫球蛋白亚类的结合特性上，ProteinA 和Protein G结合性能不太一样（详见附录1）。

本品使用的是基因改造后的蛋白A，不仅维持其本身的Ig亲和特性，同时也去除了天然蛋白本身的非主要结合域以降低非特异性结合，Protein A Agarose Resin 4FF以高度交联的琼脂糖凝胶为基质，重组Protein A为配基，具有很高的物理化学稳定性，可以在相对较高的流速下进行抗体的纯化，适用于工业客户。利用本品经过一步亲和层析，即可从腹水、血清和培养液等样品中得到高纯度的抗体，使用方便，应用广泛。

产品性质

运输与保存方法

冰袋运输。4℃保存，2年有效。

需准备试剂

注：建议以下缓冲液在使用前用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤。

结合/洗杂缓冲液：0.15 M NaCl，20 mM Na2HPO4，pH7.0

洗脱缓冲液：0.1 M甘氨酸，pH 3.0

中和液：1 M Tris-HCl，pH 8.5

使用方法

注：上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用结合/洗涤缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用结合/洗涤缓冲液透析。

1 Protein A Agarose Resin 4FF的装填

1）用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm的去离子水。

2）将树脂悬浮起来，小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。

3）如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。

4）打开层析柱底部出口，开起泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速， 这样可避免液压对所形成柱床的冲击，避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速，可以用所使用泵的最大流速，这样也可以得到一个很好的装填效果。
注：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%，当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。

5）关闭泵，关闭层析柱出口。

6）如果使用储液器，去除储液器，将分配器至于层析柱中。

7）将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。

8）将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。

2 样品纯化

1）平衡：用5倍柱体积的结合Buffer平衡层析柱，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。

2）上样：将样品加到平衡好的Protein A Agarose Resin 4FF中，保证目的蛋白与树脂充分接触，提高目的蛋白的回收率，收集流出液，待检测。

3）洗杂： 用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

4）洗脱： 使用 5-10 倍柱体积的洗脱Buffer，收集洗脱液，即目的蛋白组分。

5）清洗及保存：依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱体积的 20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4度保存，防止填料被细菌污染。

3 SDS-PAGE检测

将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

4 树脂清洗

随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量下降，影响柱子的性能，这时需对柱子进行清洗：

1）去除沉淀或变性物质

① 用2倍柱体积的6 M 盐酸胍溶液进行清洗；

② 用5倍柱体积的PBS，pH 7.4清洗。

2）去除由于疏水性吸附造成的非特异吸附物质

① 用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积的1% Triton X-100清洗；

② 用5倍柱体积的PBS，pH 7.4清洗。

注意事项

1）请勿冷冻保存本产品。

2）Protein A琼脂糖珠使用前一定要充分颠倒若干次，使琼脂糖珠混合均匀。

3）所有操作过程中，样本需要在4℃或冰上操作。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5）本产品仅作科研用途！

附录1. 蛋白A，G对不同物种Ig的结合能力总表

附录2 常见问题与解答