• Minute™ 肌肉组织及细胞线粒体提取试剂盒 MM-038_CN.pdf

产品信息

产品描述

      肌肉细胞内拥有大量的线粒体是因为肌肉细胞不断被用来驱动身体，另一种富含线粒体的器官是心脏，线粒体约占心脏细胞的40％。然而，从肌肉组织中分离线粒体并非易事，因为纤维间线粒体隐藏在肌肉纤维的深处。传统方法通常需要使用电动组织匀浆机，并使用超高速离心机，利用高密度介质（如Percoll梯度）进行纯化。本试剂盒利用了新一代离心管柱技术，可以从肌肉样品中快速，简单的分离线粒体，且易操作。从新鲜/冷冻肌肉组织中分离完整的线粒体仅需约1小时，产率高。

使用说明

线粒体分离步骤：

1. 样品准备：完全解冻缓冲液，将瓶子翻转几次并放在冰上。冰上预冷离心管柱和收集管组织样本：将一片新鲜/冷冻组织（30-40 毫克）放在干净的玻璃或塑料板的表面上。用锋利的刀片将组织切成小块直到组织转变成糊状物质（这将花费约 3-4 分钟）。将切碎的组织转移到离心管柱上。向离心管柱上加入 80mg 组织研磨粉，然后加入 200μl 缓冲液 A。用提供的塑料棒用扭转力反复将组织推到离心管柱表面重复研磨组织 2-3 分钟。再次加入 300μl 缓冲液 A 到离心管柱中。转到第 2 步。

培养的肌细胞：通过低速离心（600×g，5 分钟）收获 20-30 百万个细胞。用 1ml 冷 PBS 洗涤一次并完全除去 PBS。将沉淀重悬于 50μl 缓冲液 A 中并转移至离心管柱中。向离心管柱中加入 80mg 组织研磨粉，用提供的塑料棒用扭转力反复将组织推到离心管柱表面重复研磨组织 2-3 分钟。再次加入 300μl 缓冲液 A 到离心管柱中。转到第 2 步。

2. 盖上离心管柱并将管倒置几次，然后 16,000 X g 离心 30 秒。弃去离心管柱并短暂涡旋管以重悬沉淀。

3. 1,000 X g 离心管 5 分钟（沉淀物含有细胞核，细胞碎片和一些未破裂的细胞）。将上清液转移到新的微量离心管中，以 11,000×g 离心 20 分钟。

4. 完全去除上清液（上清是细胞浆部分，可能含有一些破碎的线粒体，特别是当使用冷冻组织时，如需要可保存）。沉淀中加入 200μl 缓冲液 B 上下吹打 30-40 次重悬，然后剧烈涡旋震荡 20 秒。

5. 11,000 X g 离心 10 分钟（此步骤离心时间范围为 5-15 分钟，对于特定样品，可进行优化以获得最佳结果。通常，缩短离心时间可以提高线粒体的产量，延长离心时间可以提高线粒体纯度但可能会降低最终产量）。离心后，将上清液转移到新的 1.5ml 离心管中，并向管中加入 0.3ml 预冷 PBS，涡旋震荡充分混匀。

6. 16,000×g 离心 20 分钟。沉淀是分离的完整的线粒体。通常，可以获得 10-100μg 蛋白质。线粒体沉淀可溶于 20-100μl 蛋白溶解液中。对于等电聚焦（2D 凝胶的第一维），我们建议使用：7M 尿素/ 2M 硫代尿素/ 2％Chaps 和 20mM DTT（在使用前将 DTT 添加到上述混合物中）。根据不同的下游应用，推荐选购以下溶解液来溶解线粒体。

储存条件

-20℃下储存。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）本产品仅作科研用途！