• 说明书丨HRN0142-TRIpure+Reagent+总RNA提取试剂.pdf

产品信息

产品描述

     TRIPure Reagent 是直接从细胞或组织中提取总 RNA 的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持 RNA 的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层(鲜红色下层)，RNA 存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的 DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的 DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化 DNA 对于样品间标准化 RNA 的产量特别有效。

      无论是人、动物、植物还是细菌组织，该方法对少量的组织(50-100mg)和细胞(5×10⁶)以及大量的组织(≥1g) 和细胞(>10⁷)均有较好的分离效果。TRIpure 试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。TRIpure 抽提的总 RNA 能够避免 DNA 和蛋白的污染。故而能够作 RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、mRNA 纯化、体外翻译、RNA 酶保护分析和分子克隆等。如果是用于 PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用扩增级的 DNase I 来处理抽提的总RNA。

      TRIpure 试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种 RNA 的析出。例如，从大鼠肝脏抽提的 RNA 琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于 7 kb 和 15 kb 之间不连续的高分子量条带(mRNA 和 hnRNA 成分)，两条优势核糖体~5 kb (28S)和~2 kb(18S)，低分子量 RNA 介于 0.1 和 0.3 kb 之间 (tRNA, 5S)。当抽提的 RNA 用 TE 稀释时其 A260/A280 比值≥1.8。

产品组分

本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。

应用范围

适用于各种动植物组织/细胞总 RNA、DNA、蛋白的快速抽提

使用方法

1. 细胞裂解或组织匀浆：
1)贴壁细胞：吸尽培养液，每10平方厘米（6孔板孔或35 mm平皿）细胞加入1 mL TRIpure Reagent,使其覆盖培养细胞，再用吸管或加样器吹打2~3次，细胞应完全裂解，然后转移至离心管中。
2)悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，每五百万至一千万（5×10⁶-1×10⁷）动植物或酵母细胞，或一千万 (1×10⁷)细菌，加入1mL TRIpure Reagent 。用吸管或加样器吹打，使其完全裂解。某些酵母和细菌如裂解不充分，可用匀浆器匀浆，以确保其完全裂解。转移至离心管中。
3)组织：先将组织剪切成小块，放入玻璃匀浆器内。冷冻组织可在研钵中研磨匀浆。每50-100mg组织加入1mL TRIpure Reagent ，匀浆至完全裂解。转移至离心管中。
裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体。室温放置5分钟。对于多糖、蛋白等杂质丰富的组织样品，匀浆后仍会存留有不溶物质，可12000×g 4℃离心10分钟，然后吸取上清至一新的离心管中。

2. 分离：在装有裂解物的离心管中加入0.2倍体积的氯仿（1 mL TRIpure Reagent 加入0.2 mL氯仿），振荡器上充分振荡混匀30秒，室温放置2-3分钟。12000×g 4℃离心10分钟，然后吸取含总RNA的上层水相至一新的离心管中，每毫升TRIpure Reagent 约可吸取0.5-0.6 mL。有机相和中间层含有DNA和蛋白质，应避免触及。

3. 沉淀：按每毫升TRIpure Reagent 加入0.5 mL异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分钟。12000×g 4℃离心10分钟，在管底可见RNA沉淀。弃上清，按每毫升TRIpure Reagent 加入1 mL 75%乙醇，轻轻颠倒混匀，以清洗RNA沉淀。12000×g 4℃离心2分钟，弃去液体，小心勿丢弃RNA沉淀。室温倒置晾干5~10分钟。

4. 溶解：加入适量DEPC处理水使RNA沉淀溶解。存放于-80℃。

参考用量

表 1. 每毫升 TRIPure Reagent 能够充分裂解的最大样本量

【注】：过多的样本量可能会导致裂解不充分，并使产物纯度降低。

操作流程

1. 匀浆化作用

（1）组织

用 glass 或强力匀浆器搅匀组织样品，每 50~100mg 组织加 1mL 的 TRIpure。匀浆化时组织样品容积不能超过 TRIpure 容积的 10%。

（2）单层生长的细胞

直接往直径 3.5 cm 的培养板中加入 1mL 的 TRIpure 溶解细胞，覆盖并反复吹打裂解细胞，通过移液管分次移出细胞裂解物。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的 TRIpure 量（每 10cm² 加 1mL）。当 TRIpure 量不足时可导致抽提的 RNA 中污染有 DNA。

（3）悬浮生长的细胞

通过离心来沉淀细胞，在 TRIpure 试剂中用移液管反复吹打来裂解细胞，每 5~10×10⁶ 的动物细胞，植物或酵母菌细胞或每 1×10⁷ 细菌加 1mL 的 TRIpure。在加入 TRIpure 前应避免洗涤细胞， 因为那样会增加 mRNA 降解的可能性。破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器。可选方案：当样品富含蛋白质，脂肪，多糖或是细胞外物质例如肌肉，脂肪组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。匀浆化后在 2~8°C 的条件下以 12,000×g 的离心力离心 10 分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量 DNA，而上层的超浮游物含有RNA。在来自于脂肪组织的样品中，大量的脂肪漂在最上层因而应该除掉。在每一个个案中，将清亮的匀浆溶液转移到一干净的试管中加入氯仿并继续进行下述的分离步骤。

2. 分离阶段

将匀浆样品在 15-30°C 条件下孵育 5 分钟以使核蛋白体完全分解。每 1mL TRIpure 加 0.2mL 氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管 15 秒并将其在室温下孵育 2~3 分钟。在 2~8°C 下以不超过 12,000×g 的离心力高速冷冻离心 15 分钟。离心后混合物分成三层：下层苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA 无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加 TRIpure 容量的60%。

3. RNA的沉淀

将水样层转移到一干净的试管中，如果希望分离 DNA 和蛋白，有机层同样要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀 RNA。最初均化时的每 1mL TRIpure 对应 0.5mL 异丙醇。将混合的样品在 15 -30°C 条件下孵育 10 分钟并在 2~8°C 下以不超过 12,000×g 的离心力高速冷冻离心 10 分钟。RNA 沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。

4. RNA的漂洗

移去上层悬液。用 75%的乙醇洗涤 RNA 沉淀一次，每 1mL 的 TRIpure 至少加 1mL 的 75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在 2~8°C 下以不超过 7,500×g 的离心力高速冷冻离心 5 分钟。

5. RNA 的再溶解

在操作的最后，简单干燥 RNA 沉淀（空气干燥或真空干燥 5~10 分钟）不要在真空管里离心干燥 RNA。尤为重要的是，不能让 RNA 沉淀完全干燥那样会极大地降低它的可溶性。部分溶解的 RNA 样品其 A260/280 比值<1.6。用移液管尖分几次移取无 RNA 酶的水或 0.5%SDS 溶液来溶解 RNA（当 RNA 以后要用于酶切反应时，避免使用 SDS。）RNA 还能被 100%甲酰胺（除去离子）再溶解并保存在-70°C。

6. 产物检测

A、RNA完整性检测

1）取 1 µLRNA 加入适当 RNA loading buffer，混匀。

2）进行电泳检测。若出现清晰的三条带，证明 RNA完整性较好。

B、RNA 纯度检测检测

260 nm，280 nm OD 值，并计算 A260/A280 比值。纯的 RNA 的比值应在 2.0 左右。

运输和保存方法

冰袋运输。2-8℃，避光保存，有效期1年。

注意事项

1.本产品中含有苯酚，具有毒性和腐蚀性。有毒物接触皮肤或者不慎吞服，会导致灼伤。一旦接触 皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。若感不适,看医生并寻求苯酚和其他成分的正确治疗方案。

2.请穿实验服并佩戴一次性手套操作，当 TRIpure用量少于 2mL 时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管，避免 RNase 污染。

3.当 TRIpure用量较大时，可以使用玻璃试管(Corex)或聚丙材质试管，事先检验以确保该试管可以耐受加入 TRIpure 和氯仿后 12,000×g 的离心力。不可使用有裂缝或者破损的试管。

4.需自备氯仿、异丙醇（新开封或提取 RNA专用）、75%乙醇 (DEPC 处理水配制)、DEPC 和 DEPC 处理水。

5.样品用TRIPureReagent 匀浆后和加入氯仿之前，样品可以在–60~–70°C 保存至少一个月。RNA 沉淀（步骤 4，RNA 漂洗）溶于 75%的乙醇在 2~8°C 至少可以保存一周，在–5~–20°C 下至少可保存一年。

6.RNA沉淀在 75%乙醇中，4℃可保存 1 周，-20℃可保存 1 年。

7.从少量的组织(1~10mg)或细胞(102~104)中分离RNA样品: 往组织或细胞中加入 800µL TRIpure。待样品裂解后，加入氯仿并进行步骤 2 中的抽提操作。在用异丙醇沉淀 RNA 之前，加入 5~10μg 无 RNA 酶的 glycogen 作为水样层的载体。为降低其黏度在加入氯仿前用 26 号注射器抽吸两次以切断基因组 DNA。Glycogen 会留在水样层中并和 RNA 共析出。在浓缩到 4mg/mL 之前它不会抑制逆转录反应第一链的合成也不会抑制 PCR。

8.RNA半衰期比较短，易降解，建议抽提后尽快进行后续实验。

9.本产品仅作科研用途！