• 说明书丨HRN0561-粪便基因组DNA快速提取试剂盒.pdf

产品信息

产品描述

      粪便中存在的大量抑制因子， 常规的DNA纯化方式并不能有效地去除，因而导致下游实验的失败。本试剂盒采用DNA吸附柱和新型独特的溶液系统，能有效去除动物粪便中各种影响下游实验（如PCR）的抑制因子，并能高效地回收粪便中的基因组DNA。动物粪便样品经特殊缓冲液ASL重悬后，70℃处理5分钟裂解细菌；离心去除不溶解的杂质，蛋白酶K消化进一步去除蛋白和杂质；然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤， 抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除， 最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

产品组分

本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。

产品特点

1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

2.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

3.快速，简捷，单个样品操作一般可在40分钟内完成。

4.多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀ 典型的比值达1.7～1.9，可直接用于PCR，Southern-blot 和各种酶切反应。

运输和保存方法

1.缓冲液 ASL 或者结合液CB低温时可能出现析出和沉淀，可以在70℃水浴几分钟帮助重新充分溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

2.蛋白酶K保存在即用型甘油缓冲液中，常温运输。收到后，不超过25℃室温至少保存6个月，4℃保存12个月，-20℃保存2年。

3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

注意事项

1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2.开始实验前将需要的水浴先预热到 70℃备用。

3.结合液 CB 和抑制物去除液 IR 中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

4.洗脱液 EB 不含有螯合剂 EDTA， 不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱， 但应该确保 pH 大于 7.5， pH 过低影响洗脱效率。用水洗脱 DNA 应该保存在－20℃。DNA 如果需要长期保存，可以用 TE 缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0），但是 EDTA 可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

5.PCR 可能被过量的 DNA（一般大于 1μg）抑制，使用最小用量的洗脱 DNA（适当稀释）反而可以得到更好的扩增。一般加入的洗脱 DNA 体积不要超过总 PCR反应体积的 10％。我们建议在 PCR 反应体系中加入终浓度 0.1 μg/μl 的 BSA（牛血清白蛋白）有助于得到最佳扩增效果。

6.本产品仅作科研用途！

使用方法

关于平衡液的使用：

介绍：核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖，以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成，请加热至 37℃使沉淀完全消失。

使用方法：取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取 100μl 的平衡液至柱子中。13000 rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。

操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

提示：第一次使用前请先在15ml漂洗液 WB中加入60ml无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

1.收集约200-220mg粪便到一个 2ml 离心管，置冰上。如果是冰冻的标本，加入缓冲液 ASL 前不能解冻，否则 DNA 容易降解。

2.加1.4ml缓冲液 ASL，连续涡旋振荡 1 分钟或者直到完全混匀均一。注意完全涡旋混匀，否则会严重降低产量。

3.将重悬物 70℃温育 5 分钟。

该加热步骤可以提高 3-5 倍 DNA 产量，并且帮助裂解细菌和寄生虫。对于某些难裂解的细胞（如革兰氏阳性菌）可以提高到 95℃。

4.涡旋振荡 15 秒，室温放置 1 分钟。最高速离心 1 分钟沉淀粪便颗粒。

5.转移 900μl 上清到一个 1.5ml 离心管，加入 100μl 杂质清除剂 AB，立刻涡旋振荡1分钟或者直到完全混匀均一，室温放置 1 分钟。最高速离心 3 分钟去除杂质。

6.转移所有上清到一个 1.5ml 离心管，最高速离心 3 分钟。

7.转移 210μl 上清到一个 1.5ml 离心管，加入 20μl 蛋白酶 K (20mg/ml)溶液，充分混匀，加入 200μl 结合液 CB，涡旋振荡 15 秒，充分混匀。70℃温育 10 分钟。

如果产量偏低，可以转移更多的上清，并且相应的按比例提高蛋白酶 K 和结合液的和后面的异丙醇使用量。

平衡液预处理吸附柱备用：

使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤，具体方法参见前文“关于平衡液的使用”

8.冷却后加入 100μl 异丙醇，涡旋混匀。

9.将上一步所得溶液和可能出现的沉淀都加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm 离心 30 秒，倒掉收集管中的废液。

10.加入500μl 抑制物去除液 IR，12,000rpm 离心 30 秒，弃废液。

11.加入600μl 漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心 30 秒，弃掉废液。

12.加入600μl 漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

13.将吸附柱 AC 放回空收集管中，13,000rpm 离心 2 分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

14.取出吸附柱 AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加 100－150μl洗脱缓冲液 EB（洗脱缓冲液可事先在 65-70℃水浴中预热）， 室温放置 2 分钟，12,000rpm 离心 1 分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置 2 分钟，12,000rpm 离心 1 分钟。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要 DNA 浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于 50μl，体积过小降低 DNA 洗脱效率，减少 DNA 产量。

15.DNA 可以存放在 2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20℃。