• Minute™ 哺乳动物细胞_组织线粒体分离试剂盒 MP-007_CN.pdf

产品信息

产品描述

      哺乳动物细胞/组织线粒体提取试剂盒可以快速的从哺乳动物细胞/组织中提取天然有活性的完整线粒体。离心管柱技术使用方便简单，高产，与其他商业试剂盒相比，可以样品处理范围更广泛，可处理5-50million/样品，缓冲液系统不含表面活性剂和EDTA，可保持线粒体活性。无需匀浆和组织研磨，操作时间<30分钟。

      细胞/组织通过Buffer A致敏，然后细胞以Z字形路径通过离心管柱，在这个过程中细胞膜会破裂。进而通过差速离心和密  度离心分离出完整的线粒体，整个过程无需匀浆和超高速离心。

应用

      提取出的线粒体可以应用于SDS-PAGE，immunoblottings,ELISA,IP,膜蛋白结构分析，2-D，酶活性检测，也可作为提取线粒体DNA，RNA等分子生物学研究的起始原料及其他应用。

使用说明

1.将缓冲液 A 和缓冲液 B 完全解冻后摇匀，放置于冰上。将离心管柱和接收管套管放置于冰上预冷。

2. 低速离心（500-600Xg，5 分钟）收集 10-40 X 106 个细胞。（建议使用 3-4X107 个细胞效果为佳）

3. 用 1ml 预冷的 PBS 清洗一次细胞。弃去上清，加入 250ul Buffer A 涡旋震荡重悬细胞。冰上孵育 5-10 分钟，涡旋大力震荡 20-30 秒。将细胞悬液转入离心管柱中。接转步骤 4。组织样品，将新鲜组织或冷冻组织（20-30mg）放置于离心管柱上。加入 250ul Buffer A，用塑料棒反复扭转研磨组织 1 分钟，如果你的样品是肌肉请选用 MinuteTM 肌肉组织及细胞的线粒体提取试剂盒(Cat# MM-038）。开盖冰上孵育 5 分钟。接转步骤 4.

注意：少量非均质组织不会影响样本质量。塑料棒可重复使用，用 75%酒精擦拭或用蒸馏水冲洗干净。

4.盖上盖子， 16,000Xg 离心 30 秒。（需要最短时间达到设定转速），弃去离心管柱，涡旋震荡重悬沉淀。

可选优化：细胞样品建议第 4 步完成后再次重悬细胞，转移回同个离心管柱中，16,000Xg 再次离心 30 秒，重复此步骤可以增加 20-30%产量。

5.涡旋震荡重悬沉淀，700Xg 离心 1 分钟（沉淀为细胞核），小心的将 250ul 上清液转移到新的 2.0ml离心管中，加入 300ul 缓冲液 B（上清液和缓冲液 B 比例为 1：1.2 即 250ul/300ul），涡旋震荡 10秒混合溶液。注意：这个比例可以在 1：1 到 1：1.6（250ul/400ul）之间调整。如果最终线粒体得率比较低可以调整缓冲液 B 比例为 1：1。如果得到的线粒体交叉污染比较严重可以调整缓冲液 B比例为 1：1.5 或者 1：1.6。

6. 16,000Xg 离心 10 分钟（如果最终线粒体产量过低，可以将此步离心时间延长至 30min）。弃去上清液（上清液包含胞浆和质膜蛋白），加入 200ul 缓冲液 B 涡旋震荡 10 秒重悬沉淀。

7. 8000Xg 离心 5 分钟（沉淀为比线粒体大的细胞器）。将上清液转移到新的 2.0ml 离心管中。加入 1.6ml 预冷的 PBS，16,000Xg 离心 15-30 分钟。弃去上清液（上清为比线粒体小的细胞器），保存沉淀（沉淀为分离出的线粒体）。一般可获得 10-200ug 蛋白。线粒体蛋白可以根据下游实验需求使用 10-200ul 含有表面活性剂的缓冲液溶解。推荐使用下表中 MinuteTM 系列溶解液溶解线粒体。做等电聚焦（2D 凝胶第一维）我们建议使用：7M 尿素/2M 硫脲/2%Chaps 和 20mM  DTT (使用前将 DTT 加入以上混合液中)

储存条件

-20℃下储存。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）本产品仅作科研用途！