• 说明书丨L-1009 -Anti-HA Magnetic Beads磁珠.pdf
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产品信息:

产品描述:

     Anti-HA 磁珠是粒径为 200nm 的纳米 磁珠表面上共价结合了大量的高质量的鼠源抗 HA 单克隆抗体，纳米级磁珠提供的超大比表面积，具有更多的结合 位点，磁珠使用量更少，非特异性吸附率低。本产品广泛 应用于细胞裂解物、细胞分泌上清、血清、腹水等样品中 带有 HA 标签融合蛋白的免疫沉淀（IP）或免疫共沉淀 （Co-IP）。由于采用磁性分离，使得每次 IP 和 Co-IP 可 以节省 40%的时间。

产品特性：

操作流程：

注意：缓冲液自行准备或直接购买我司 IP 试剂盒。 贴壁细胞样品： 

1.移去培养基，用 PBS 洗细胞两次。

2. 收集细胞至 1.5mL EP 管内，按比例加入 IP Lysis/Wash Buffer，同时加入 PMSF 等相应的抑制剂，混匀后置于冰 上静置 5∽20min（期间混匀几次）。

3. 4℃, 12000∽16000xg,10min 离心收集上清液，置于冰 上以备后续实验（或置于-80℃长期保存）。

培养皿 IP Lysis/Wash Buffer 推荐使用体积：

悬浮细胞样品：

1. 4℃、500∽1000xg、10min，收集细胞，弃上清。
2. 用 PBS 洗细胞一次，即用 PBS 将细胞团重悬，4℃、500∽1000xg、5min，收集细胞，弃上清。
3. 用预冷的 IP Lysis/Wash Buffer 重悬细胞。每 50mg细胞使用 500μL IP Lysis/Wash Buffer。同时加入 PMSF等相应的抑制剂，混匀后置于冰上静置 5∽20min（期间混匀几次）。
4. 4℃,12000∽16000xg,10min 离心收集上清液，置于冰上以备后续实验（或置于-80℃长期保存）。

血清样品：

       一般建议建议用 IP Lysis/Wash Buffer 稀释血清样品 至目标蛋白终浓度为 50~150µg/mL，置于冰上备用（或 置于-20℃长期保存）。

免疫沉淀：

注意：为保证磁珠均匀分布，使用前通过反复颠倒或轻微涡旋混匀瓶中磁珠。

1. 将20∽50µL的Anti-HA磁珠加入1.5mL离心管中。
2. 向磁珠中加入 500µL 预冷 PBS，轻柔混匀。
3. 将离心管放入磁力架中收集磁珠到离心管的一边。去除上清。
4. 向离心管中加入 200∽500µL IP Lysis/Wash Buffer。颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀 1min。用磁力架收集磁珠。去除上清。

5. 将含有HA标签标记的蛋白样品加入装有磁珠的离心管中，保持混匀室温下孵育 1∽2h，或 4℃ 2∽4h。
6. 用磁力架收集磁珠，除去未结合的样品，保存以备分析。
7. 向离心管中加入 1000µL IP Lysis/Wash Buffer，轻柔混匀磁珠 5∽10min。收集磁珠，弃上清。再重复洗两次。
8. 变性洗脱：向离心管中加入 80∽100µL SDS-PAGE Sample Loading Buffer（1×），将样品置于 100℃水浴或者金属浴中加热 10min。通过磁力架分离磁珠，保留含有目的抗原的上清。

备注:如需保持蛋白活性，也可采用以下洗脱方式。

低 pH 洗脱：向离心管中加入 100µL Elution Buffer。保持混匀在室温下孵育离心管 5∽10min。通过磁力分离磁珠，保留含有目的抗原的上清。每 100µL 洗出液中加入20µL Neutralization Buffer 来中和低 pH。

注意事项：

1. 进行实验操作之前，请务必认真阅读本操作说明书。
2. 请勿高速离心、干燥或冷冻磁珠，这些操作会导致磁珠聚集而降低结合能力。
3. IP 实验中不同类型的抗体与抗原结合的亲和性是有区别的，抗体与抗原结合还会受到 IP Lysis/Wash Buffer 的影响，因此可自行优化操作细节或者筛选及配制缓冲液进行实验。
4. 磁珠使用前应充分振荡均匀。磁珠应保存在储存溶液中，防止干燥。
5. 本产品仅供科学研究使用。

问题解决：

1.抗原没有免疫沉淀下来

① 样品中所含的抗原过少，不足以被检测

建议：通过 SDS-PAGE 或蛋白免疫印迹验证裂解液 中蛋白的表达和/或裂解效率； 如果需要，加大样品量 。

② IP Lysis/Wash Buffer 中的成分干扰了抗原与抗体的结合

 建议：使用其它缓冲液进行免疫沉淀和漂洗（例如， 含有 0.5% CHAPS 的 TBS）

2.获得的蛋白量低

 ① 蛋白质被降解

 建议：加入蛋白酶抑制剂

② 所使用的磁珠量不够

 建议：提高捕获免疫复合物所使用的磁珠量

③ 样品中的目标蛋白量不够

 建议：提高抗原样品量

3.多条非特异条带 有非特异性的蛋白结合在磁珠上

建议：在 IP Lysis/Wash Buffer 中加入 50∽350mM NaCl。加大洗脱力度和次数。

4.磁珠聚集 

磁珠在低 pH 的 Elution Buffer 中发生聚集属于正常 现象，不影响磁珠的正常使用。

 建议：用 IP Lysis/Wash Buffer 至中性，然后用含有 0.1%（v/v）Tween-20 的 Tris buffer（pH7.5）振 荡重悬磁珠，并用超声波水浴处理，即可使磁珠恢复 均匀状态，以上处理均不影响磁珠的抗体结合效率。 也可添加终浓度为 0.1%（v/v）的非离子型去垢剂（如 Tween-20 或 Triton X-100）可有效防止磁珠聚集。

注意：超声处理也会使磁珠在样品溶液中捕获的抗体 脱落，所以磁珠在加样后洗脱前不宜使用该方法。