EdU-555细胞增殖检测试剂盒(适用于FACS、FM)

EdU-555细胞增殖检测试剂盒(适用于FACS、FM)

价格:825

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产品信息 

 

产品名称

产品编号

规格

EdU-555细胞增殖检测试剂盒(适用于FACS、FM)

HR0425

50-500T

 

产品描述

EdU-555细胞增殖检测试剂盒(FuHeng EdU Cell Proliferation Kit with Alexa Fluor 555) ,是一种利用核苷渗入法对细胞增殖情况进行快速、简单、高灵敏检测的试剂盒。其原理为:试剂盒中的EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)是一种胸苷(T)类似物,EdU可以在细胞周期的S期中替代胸苷掺入到新合成的DNA中;另一方面,EdU上的乙炔基能与叠氮 化物(如荧光探针Alexa Fluor 555 Azide)通过Cu+的催化发生共价反应,形成稳定的三唑 环,该反应非常迅速,被称作点击反应(Click reaction) (图1) 。通过点击反应,新合成的 DNA会被红色荧光标记,然后通过检测荧光信号实现细胞增殖的检测。

图1. EdU法中的点击反应原理图。 掺入到细胞DNA中的EdU与荧光探针或生物素等标记的叠氮化物,在铜离子的催化下发生共价反应,形成稳定的三唑环,使细胞DNA标记上荧光探针或生物素。

细胞增殖检测是评估细胞活性、遗传毒性及抗肿瘤药物效果等的基础实验手段。 细胞增殖检测的方法按照原理通常可以分为五类:膜损伤检测、代谢活性检测、ATP水平测定、 DNA合成检测和细胞荧光标记检测法。目前公认的最精确的检测细胞增殖的方法是直接检测细胞中DNA的合成,即核苷渗入法。以前常用的核苷渗入法是BrdU(胸腺嘧啶核苷酸类似物)法,但BrdU法的缺点是需要变性DNA后才能与抗体结合,导致了DNA双链结构的破坏,影响了其他染料的结合染色,导致染色弥散,准确性降低等问题。 EdU法作为新型的核苷渗入法具有以下优点:

◆安全-----不使用[3H]thymidine,无放射性污染。

◆ 简单-----基于小分子化学反应的检测方法,简单高效,仅需三步: EdU孵育;细胞固定;荧光检测。无需DNA变性和孵育抗体。

◆ 快速-----无需过夜,省却抗原抗体反应。整个检测过程只需 2.5 小时,大大缩短实验周期。

◆ 准确-----标记率高且无需DNA变性(酸解、热解、酶解等),可有效避免变性带来的样品损伤,确保细胞核边缘清晰完。

◆ 灵敏-----无需抗体,检测染料仅为BrdU抗体的1/500,更容易扩散,即使单个增殖细胞也能准确检测。

◆ 兼容-----对样品几乎无损伤,允许与多种抗体或荧光蛋白同时标记,能够同时检测细胞其他性状特征。

本试剂盒适用于培养的细胞或组织样品,也适用于组织切片,可以检测到细胞或组织样本中的单个增殖细胞,也可以对细胞或组织样本总体的细胞增殖情况进行定量分析。本试剂盒包含EdU法检测所需要的所有组份, 同时提供了蓝色细胞核染料Hoechst 33342 ,可以用来复染所有细胞核,也可用于细胞周期分析。使用本试剂盒所做结果可以用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪进行检测,也可以用于高内涵筛选(High-Content Screening, HCS)。针对6孔板培养的细胞(每孔500μl的Click反应液),本试剂盒可以提供50个孔反应的量;针对96孔板培养的细胞(每孔50μl的Click反应液) ,本试剂盒可以提供500个孔反应的量(不同容器细胞Click反应液的具体用量可参考表1) ;针对每管细胞数量为10- 100万的流式细胞仪检测(每管500μl的Click反应液) ,本试剂盒可以提供50管反应的量;针对冰冻或石蜡切片的检测(每个样品100-200μl的Click反应液),本试剂盒可以提供125-250个样品反应的量。

光谱特性: 555-Azide :红色荧光, Ex/Em=555/567 nm; Hoechst 33342: 蓝色荧光,Ex/Em=346/460nm, bound to DNA。

产品组分

产品组成

HR0424  50-500T

EdU(10mM)

200 μl

488-Azide

55 μl

Click-iT Reaction Buffer

30 ml

CuSO4

1.1 ml

Click-iT Additive

2 管

(Add 1.3ml/tube ddH2O to dissolve)

Hoechst 33342(1000X)

50 μl

运输和保存方法

-20℃保存, 一年有效。488-Azide和Hoechst 33342(1000X)须避光保存。

使用方法

  1. 需自备试剂

(1)10mM PBS, pH7.2-7.6

(2)固定液-----4%多聚甲醛in PBS 。

(3)洗涤液-----3% BSA in PBS , pH7.2-7.6。

(4)通透液-----0.3~0.5% Triton X-100 in PBS。

(5)去离子水或超纯水。

2.检测体系的确定

(1)以下操作步骤是以6孔板或常规切片检测体系为例的,如果使用其他容器,检测体系可以相应按比例调整,具体检测时Click反应液的使用量请参考表1。

(2)以下操作步骤是以贴壁细胞或组织切片为例的,如果检测的是悬浮细胞,请按常规 的悬浮细胞的操作方式进行,比如在相关步骤中增加离心步骤等。细胞数在10-100万的悬浮细胞可以使用500u的检测体系,可以根据细胞数的多少相应调整检测体系。

表1. Click反应液的使用量参考

细胞接种容器

384孔板

96孔板

48孔板

24孔板

12孔板

6孔板

5.5cm皿

Click反应液体积

20μl

50μl

70μl

100μl

200μl

500μl

1ml

3.EdU标记与固定、通透

3.1对于培养细胞

(1)将适当数量的待测细胞接种于6孔板中,培养过夜至恢复正常状态后,进行所需要的药物处理或者其它刺激处理。

(2)配制2XEdU工作液:用完全培养基稀释EdU( 10mM)至合适的浓度,配成2X的EdU

工 作液。例如,推荐的EdU工作液(1X)的终浓度为10μM ,那么需要用完全培养液1:500

稀释EdU( 10mM)至浓度为20μM,即配成2XEdU工作液(20μM)。

【注】EdU的使用浓度应根据所使用的的细胞类型做相应的优化,推荐用户以10μM的EdU初始浓度进行摸索优化,一般的贴壁肿瘤细胞使用10μM就可以。细胞培养基种类、细胞类型、细胞生长密度和增殖速度等多方面因素都有可能影响EdU的掺入效果,因此建议用户在预实验中设置一系列的EdU浓度梯度,以确定最佳浓度。如果之前使用过BrdU进行实验,则可以参考BrdU的终浓度作为EdU的终浓度。您也可以参考附表1.细胞实验EdU孵育浓度及时间参考。

(3)37℃预热2XEdU工作液,等体积加入6孔板中,使6孔板中的EdU终浓度变为1X 。例如如果终浓度为10μM ,6孔板中每孔原来有培养基1ml,则将1ml 2XEdU工作液(20μM)加入到每孔中。如果培养基原有体积过大,可以先吸除适量的培养基,再加入与剩下培养基等体积的2XEdU工作液;或者可以增加EdU的浓度并减少工作液的体积,例如2ml培养液中加入220μl 10XEdU工作液(100μM)。

【注】更换所有的培养液可能会对细胞的增殖有影响,因此不建议更换所有的培养液。

(4)继续孵育细胞适当时间。该孵育时间的长短取决于细胞生长速率,通常宜继续孵育细胞周期10%左右的时间。您也可以参考附表2.常见细胞系EdU孵育时间参考。

【注】孵育时间小于45min时,建议提高EdU的浓度;孵育时间大于20h时,建议适当降低EdU的浓度。

(5)EdU标记完成后,去除培养基。

【注】若最后做流式检测,样本为贴壁细胞,则用胰酶将细胞消化下来,收集细胞 ,之后每一步去除液体的步骤都需要500-1000×g离心3-5min, (6)加入1ml 固定液,室温固定15-30min。

(7)去除固定液,以每孔1ml的洗涤液洗涤细胞3次,每次3-5min。

(8)去除洗涤液,加入1ml通透液,室温孵育10- 15min。

(9)去除通透液,以每孔1ml的洗涤液洗涤细胞1-2次,每次3-5min。

(10)转步骤4。

 

3.2对于组织切片样本

可以通过注射或进食等方式进行动物体内的EdU标记。 以下是以小鼠为例的,其它动物体内EdU标记条件请参考相关文献,也可以参考附表3进行条件优化。

(1)用PBS配制成一定浓度的EdU ,对于小鼠,可按照10-200mg/kg的用量进行腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水。

【注】EdU具体用量与动物的种类、体重和使用方式有关,可以参考相关文献,因此建议用户在预实验中设置一系列的EdU浓度梯度,以确定最佳浓度。推荐用户以50mg/kg的EdU初始浓度进行摸索优化。如果之前使用过BrdU进行实验,则可以参考BrdU的终浓度作为EdU的终浓度。或者直接使用50mg/kg的浓度进行测试。也可以参考附表2。

(2) EdU标记4小时后或根据特定实验确定的适当时间后,快速处死小鼠,取出所需组织,按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EdU标记的时间也根据相关参考文献自行调整。

(3)对于冰冻切片:

  1. 加入适量固定液,室温固定15min。
  2. 去除固定液,用适量洗涤液洗涤3次,每次3-5min。
  3. 去除洗涤液,加入适量通透液,室温孵育10- 15min。
  4. 去除通透液,用适量洗涤液洗涤1-2次,每次3-5min。
  5. 抗原修复(选做):如果同时需要进行目的蛋白的免疫荧光染色,并有必要进行抗原修复,可以使用适当的抗原修复液进行抗原修复处理。
  6. 转步骤4。

(4)对于石蜡切片:

  1. 脱蜡: 二甲苯中脱蜡5- 10min 。换用新鲜的二甲苯,再脱蜡5- 10min 。无水乙醇5min ,换新的无水乙醇3min 。95%乙醇3min 。85%乙醇3min 。75%乙醇3min 。50%乙醇3min 。PBS 5min。
  2. 抗原修复(选做):如果同时需要进行目的蛋白的免疫组化染色,可以使用适当的抗原修复液进行抗原修复处理。

【注】如果使用蛋白酶K或胰酶进行抗原修复,修复后须反复洗涤干净,避免残留的酶干扰后续标记反应。

4.EdU检测

【注】本参考步骤每个样品的反应体系为500μl的Click反应液。用户可根据自己的样本情况参考表1适当调整。对于切片,可以根据切片大小,每个切片使用100-200μl的Click反应液,其余步骤相同。

(1)配制Click-iT Additive Solution:用1.3ml去离子水/管溶解Click-iT Additive 。混匀至全

部溶解,即为Click-iT Additive Solution 。配制后请按照每次用量适当分装,并-20℃保存,溶液一旦呈现棕色,则说明有效成分降解不能再用。

(2)请参考下表配制Click反应液。

【注】请严格按照下表中组分顺序和体积配制Click反应液,否则Click反应可能无法有效进行。Click反应液须在配制后15分钟内使用。

组分

以 6 孔板为例的样品数

1

2

5

10

50

Click-iT Reaction Buffer

430μl

860μl

2.15ml

4.3ml

21.5ml

CuSO4

20μl

40μl

100μl

200μl

1ml

555-Azide

1μl

2μl

5μl

10μl

50μl

Click-iT Additive Solution

50μl

100μl

250μl

500μl

2.5ml

总体积

500μl

1ml

2.5ml

5ml

25ml

(3)去除上一步骤中的洗涤液。每孔加入500μl Click反应液,轻轻摇晃培养板以确保Click反应液可以均匀覆盖样品。

(4)室温避光孵育30min。

(5)吸除Click反应液,以每孔1ml的洗涤液洗涤细胞3次,每次3-5min。

(6)此时增殖细胞被标记了明亮的红色荧光。如无其它特殊要求,即可在荧光显微镜下观察,或者使用流式细胞仪(用500μl洗涤液重悬细胞后上机)、多功能酶标仪、高内涵筛选仪器(一般高内涵筛选需要细胞核复染)进行荧光检测分析。555-Azide 的最大激发波长是

555nm ,最大发射波长是567nm 。如果需要检测细胞增殖的比例,可以参照步骤5对细胞

核进行复染。

5.细胞核染色

(1)1X Hoechst 33342溶液的配制:用PBS按1:1000比例稀释Hoechst 33342(1000X)。

(2)吸除步骤5(5)洗涤液,每孔加1ml的1X Hoechst 33342溶液,室温避光孵育10min。

(3)吸除1X Hoechst 33342溶液,以每孔1ml的洗涤液洗涤细胞3次, 每次3-5min。

(4)随后即可进行荧光检测。 Hoechst 33342为蓝色荧光,最大激发波长为346nm,最大

发射波长为460nm。

注意事项

  1. 羟基脲(Hydroxyurea)为 DNA 合成抑制剂,经过 10mM 羟基脲提前 30min 处理的细胞,红色荧光阳性的细胞几乎完全消失,因此常被用作 EdU 实验的 阴性对照。
  2. 配制好的 Click-iT Additive Solution 请根据每次用量适当分装后-20℃保存,避免反复冻融。Click-iT Additive Solution 融化后有白色物质析出为正常现象,请上下颠倒几次,待全部溶解后使用。溶液一旦呈现棕色,则说明有效成分降解,不能再使用。
  3. 皂苷促渗液可以用于全血及含红细胞的细胞悬液, 以及其他含多种细胞类型的混合细胞悬液的通透。这种促渗液可以在裂解红细胞的同时,维持白细胞的光散射特性。
  4. 本试剂盒做动物实验时可能需要更多的 EdU ,请根据实验需求 用合适稀释液稀释后使用。
  5. 由于本产品涉及到铜离子催化进行点击反应,请注意以下的兼容性问题及解决方案。本产品完全 兼容有机类染料如Alexa Fluor®系列普通染料及fluorescein (FITC) 、Allophycocyanin (APC)及 APCE-tandems 染料;对于 Qdot®纳米晶体探针、Horseradishperoxidase (HRP) 、 R-phycoerythrin (R-PE)和 R-PE-tandems 染料如 Alexa Fluor® 680- R-PE 等,需要在点击反应完成后进行反应和检测;本产品会影响 GFP、RFP、mCherry等荧光蛋白的荧光,对于荧光类蛋白如 GFP、TC-FlAsH™和 TC-ReAsH™类试剂,需要在点击反应前进行反应和检测。Phalloidin (鬼笔环肽)不兼容点击反应,在检测细胞微管时请选用其它探针。
  6. 如需在传统流式仪上进行总 DNA 含量的检测,可采取低流速检测。DNA 含量检测所用

荧光检测信号应与 DNA 含量成线性关系。EdU 标记信号呈现对数放大可以很好的被检测到。

  1. 为了您的安全和健康,操作时请穿着实验服并佩戴一次性手套。
  2. 本产品仅供科研用途!
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