3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)试剂盒

3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)试剂盒

价格:6,500

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产品信息

 

产品名称

测定方法

产品编号

规格

3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)试剂盒

微量法

HRK1122

100管/96样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

 

测定意义

 

GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸,是糖酵解途径的关键酶,与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关,在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。

 

测定原理

 

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD,340nm处测定NADH的减少量可反映GADPH活性的高低。

 

需自备的仪器和用品

 

分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

 

试剂的组成和配制

 

提取液一:液体100mL×1瓶,4℃保存。

提取液二:液体100mL×1瓶,4℃保存。

试剂一:粉剂×1瓶,-20℃保存;

试剂二:液体20mL×1瓶,4℃保存;

试剂三:液体14uL×1支,4℃保存;

 

组织样本的前处理

 

①总GAPDH提取:建议称取约0.1g样本,加入1mL提取液一,冰浴匀浆后超声破碎(冰浴,200W,破碎3s,间歇7s,总时间1min),然后4℃,8000g离心10min,取上清测定。

②胞浆和叶绿体GAPDH酶的分离:按照植物组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g样本,加入1mL提取液一),冰浴匀浆后于4℃,200g离心5min,弃沉淀,取上清在4℃,8000g离心10min,取上清用于测定胞浆GAPDH酶活性,取沉淀加1mL提取液二,震荡溶解后超声破碎(冰浴,200W,破碎3s,间歇7s,总时间1min),然后4℃,8000g离心10min,取上清测定叶绿体中GAPDH酶活性。

建议测定总GAPDH酶活性,按照步骤①提取粗酶液,若需要分别测定胞浆和叶绿体中的GAPDH,则按照步骤②提取粗酶液。

 

细菌或培养细胞的前处理

 

先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

 

测定步骤

 

1.分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2.样本测定

(1)工作液的配制:将试剂二全部倒入试剂一瓶中,充分溶解,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

(2)在试剂三中加入500μL蒸馏水,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL样本、5μL试剂三和190μL工作液,混匀,加入最后一个试剂的同时开始计时,记录340nm处20s时的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。

 

GAPDH活性计算

 

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=1286×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每一万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500 ×V样÷V样总) ÷T=2.572×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.005 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

 

b.96孔板测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=2572×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=2572×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每一万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500 ×V样÷V样总) ÷T=5.144×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.005 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

注意事项

本产品仅作科研用途!

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